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Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟影响的研究

2020-12-11阅读(668)

Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟影响的研究

论文摘要

Ghrelin是日本科学家Kojima1999年发现的一种由28个氨基酸组成的新的内源性脑肠肽,是生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor, GHS-R）的天然配体。Ghrelin与其受体结合后有着广泛的生理功能。因此,Ghrelin的研究进展是目前人们所关注的一个热点。随着动物细胞工程、胚胎工程研究的不断深入,影响动物卵母细胞成熟因素的相关报道主要是一些生殖激素的相关作用原理。那么Ghrelin作为生长激素促分泌素受体的天然配体,它是否参与了绵羊卵母细胞成熟,是否通过经典的与细胞生长有关的MAPK信号通路发挥作用至今未见报道。由于卵母细胞在成熟过程中部分发生凋亡,而抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax的表达状况决定了雌性生殖细胞存活与否,Ghrelin在卵母细胞成熟过程究竟与Bcl-2和Bax有何关系目前尚不清楚。针对以上这些悬而未决的问题本论文通过在绵羊卵母细胞体外成熟体系中添加Ghrelin以及Ghrelin的受体（GHS-R）特异性拮抗剂D-Lys3-GHRP-6,研究了Ghrelin在绵羊卵母细胞成熟过程中的作用,与MAPK信号级联以及Bcl-2和Bax的关系,结果如下:1、Ghrelin受体GHS-R在绵羊卵母细胞的表达采用RT-PCR技术成功检测到Ghrelin受体GHS-R在绵羊卵母细胞的表达。2、Ghrelin对绵羊卵母细胞成熟的影响（1）Ghrelin对卵母细胞第一极体排出率、核成熟率有促进作用。而且呈浓度依赖性。（2）D-Lys3-GHRP-6作为Ghrelin受体GHS-R的特异性拮抗剂对卵母细胞第一极体排出率、核成熟率无影响。（3）D-Lys3-GHRP-6可阻断Ghrelin对卵母细胞体外成熟的促进作用,且对GHS-R拮抗的越完全,Ghrelin的促进作用被阻断的越显著。说明Ghrelin是通过与受体GHS-R的结合而发挥其对卵母细胞的促成熟作用的。3、实时荧光定量PCR检测Ghrelin对绵羊卵母细胞MAPK（ERK1/2）、p90rsk mRNA表达的影响（1）Ghrelin对卵母细胞MAPK（ERK1/2）、p90rsk mRNA的表达有上调作用,且存在着明显的剂量、时间依赖关系。（2）D-Lys3-GHRP-6对卵母细胞体外成熟时MAPK（ERK1/2）、p90rsk mRNA的表达没有影响。（3）Ghrelin对MAPK（ERK1/2）、p90rsk mRNA表达的促进作用可被Ghrelin受体（GHS-R）拮抗剂D-Lys3-GHRP-6阻断,且此阻断作用呈浓度依赖性。4、Western blotting检测MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白在绵羊卵母细胞的表达及Ghrelin对磷酸化的MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白表达的影响（1）MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白在卵母细胞体外成熟过程中表达量没有明显变化。（2）卵母细胞体外成熟10h时, MAPK（ERK1/2）、p90rsk被激活,直到24h仍维持高活性。说明卵母细胞MAPK（ERK1/2）、p90rsk是在GVBD期后被激活的。（3）Ghrelin对MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白的表达有上调作用。（4）Ghrelin对MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白表达的上调作用可被D-Lys3 -GHRP-6阻断。（5）在卵母细胞体外成熟过程中p90rsk的激活与MAPK（ERK1/2）一致。（6）Ghrelin在卵母细胞体外成熟中所起作用是通过MAPK信号系统发挥效应的,其增加卵母细胞GVBD后磷酸化的MAPK（ERK1/2）、p90rsk的表达是通过Ghrelin受体介导的。5、实时荧光定量PCR检测Ghrelin对绵羊卵母细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响（1）Ghrelin对卵母细胞Bcl-2 mRNA的表达有上调作用。（2）Ghrelin对绵羊卵母细胞Bax mRNA的表达有下调作用。（3）Ghrelin对Bcl-2、Bax mRNA表达的上调、下调作用可被Ghrelin受体（GHS-R）拮抗剂D-Lys3-GHRP-6阻断,且此阻断作用成浓度依赖性。（4）Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟中Bcl-2、Bax mRNA的表达所起作用是通过Ghrelin受体介导的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  • 1.1 Ghrelin 研究概述
  • 1.2 Ghrelin 的发现
  • 1.3 Ghrelin 的分子结构及其在组织中的分布
  • 1.3.1 Ghrelin 的分子结构
  • 1.3.2 Ghrelin 的分布
  • 1.4 Ghrelin 受体及定位
  • 1.4.1 Ghrelin 受体
  • 1.4.2 Ghrelin 受体定位
  • 1.5 Ghrelin 的作用机制
  • 1.6 Ghrelin 的生理功能
  • 1.6.1 促进GH 释放
  • 1.6.2 影响神经内分泌
  • 1.6.3 促进摄食，调节体重，参与能量平衡的调节
  • 1.6.4 对胃肠功能和胃酸分泌的影响
  • 1.6.5 对细胞增殖的影响
  • 1.6.6 Ghrelin 对胰岛功能的影响
  • 1.6.7 Ghrelin 与学习和记忆功能
  • 1.6.8 Ghrelin 与睡眠
  • 1.6.9 Ghrelin 在生殖系统中的作用
  • 1.6.10 Ghrelin 与人类疾病的关系
  • 1.7 MAPK 信号通路
  • 1.7.1 MAPK 信号通路概述
  • 1.7.2 MAPK 信号通路与卵母细胞
  • 1.8 绵羊Ghrelin
  • 1.9 Ghrelin 前景与展望
  • 1.10 本研究的目的及意义
  • 1.11 本论文的实验路线设计
  • 2 实验一 Ghrelin 对绵羊卵母细胞体外成熟的影响
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 材料及卵母细胞的体外成熟培养
  • 2.1.2 仪器和试剂
  • 2.1.3 卵母细胞Ghrelin 受体（GHS-R）的检测
  • 2.1.4 卵母细胞体外成熟的判定标准
  • 2.1.5 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞成熟的影响
  • 2.1.6 统计分析
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 不同成熟培养时间COCs 状态
  • 2.2.2 成熟培养24h 具有明显极体的卵母细胞
  • 2.2.3 卵母细胞减数分裂各个时期的核相
  • 2.2.4 卵母细胞Ghrelin 受体（GHS-R）的检测
  • 2.2.5 不同浓度的Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的影响
  • 2.2.6 不同浓度D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞体外成熟的影响
  • 2.2.7 Ghrelin与D-Lys3-GHRP-6协同对绵羊卵母细胞体外成熟的影响
  • 2.3 讨论
  • 2.4 小结
  • 3 实验二 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6 在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对 MAPK（ERK1/2）mRNA 及蛋白表达的影响
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 仪器和试剂
  • 3.1.3 实时荧光定量PCR检测Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞MAPK(ERK1/2 mRNA表达的影响
  • 3.1.4 Western blotting 检测 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6 对绵羊卵母细胞体外成熟 过程中 MAPK（ERK1/2）蛋白的表达
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 实时荧光定量PCR 检测Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞MAPK（ERK1/2） mRNA表达的影响
  • 3.2.2 Western blotting 检测 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6 对绵羊卵母细胞体外成熟 过程中 MAPK（ERK1/2）蛋白的表达
  • 3.3 讨论
  • 3.4 小结
  • 4 实验三 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6 在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对 p90rsk mRNA、 蛋白表达的影响
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 仪器和试剂
  • 4.1.3 实时荧光定量PCR 检测Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞p90rsk mRNA 表达的影响
  • 4.1.4 Western blotting 检测 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6 对绵羊卵母细胞体外成熟 过程中 p90rsk蛋白的表达
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 实时荧光定量PCR 检测Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞p90rsk mRNA 表达的影响
  • 4.2.2 Western blotting 检测 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6 对绵羊卵母细胞体外成熟 过程中 p90rsk-1蛋白的表达
  • 4.3 讨论
  • 4.4 小结
  • 5 实验四 Ghrelin 在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对 Bcl-2、Bax 的mRNA 表达的影响
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 实验材料
  • 5.1.2 仪器和试剂
  • 5.1.3 绵羊卵母细胞的体外成熟培养及卵母细胞的获得
  • 5.1.4 绵羊卵母细胞总RNA 的提取及检测
  • 5.1.5 实时荧光定量PCR（Real Time PCR）
  • 5.1.6 实时荧光定量PCR 产物cDNA 的序列测定
  • 5.1.7 Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响
  • 5.2 结果
  • 5.2.1 绵羊卵母细胞不同培养时间绵羊卵母细胞总RNA 的检测
  • 5.2.2 Bcl-2、Bax、β-actin 的实时荧光定量 PCR 产物的特异性及鉴定
  • 5.2.3 质粒的酶切分析
  • 5.2.4 实时荧光定量PCR 产物的测序
  • 5.2.5 实时荧光定量PCR 检测Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞Bcl-2 mRNA 表达的影响
  • 5.2.6 实时荧光定量PCR 检测Ghrelin、D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞Bax mRNA表 达的影响
  • 5.3 讨论
  • 5.4 小结
  • 6 全文总结
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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