小麦与条锈菌互作过程中活性氧迸发的组织学和细胞化学研究

论文摘要

在植物与病原菌互作过程中,植物会产生一系列的防卫反应来抵御病原菌的入侵与扩展。在这些防卫反应中,寄主最快的抗病反应就是在短时间内产生大量的活性氧物质,即氧化迸发（oxidative burst）。虽然过量的活性氧积累会对植物细胞造成很强的毒害,但其在植物的抗病反应中却起着重要作用。自1983年Doke首次发表了有关非亲和病原物可以引起植物组织内产生O2-的文章以来,有关活性氧生理功能、产生机制、化学变化和清除系统等方面已进行了大量的研究。然而,小麦与条锈菌互作中活性氧迸发的特征及在抗病性表达中的作用方面的研究,目前国内外尚无报道。因此,本研究以小麦品种水源11与条锈菌毒性和非毒性小种（CY31和CY23）组成的亲和与非亲和互作体系为研究对象,对不同互作体系中的组织学特征和细胞学特征进行了研究,并利用NBT、DAB组织化学染色法来明确不同组合间O2-和H2O2产生的时间变化特征,利用电镜细胞化学标记技术在亚细胞水平上对O2-、H2O2和过氧化物酶的空间分布进行了定位,并检测了不同组合间活性氧迸发与相关酶系的变化关系及活性氧清除剂处理对寄主细胞过敏性坏死发生的影响,以明确活性氧迸发在小麦抗条锈性中的作用,从而为进一步揭示小麦抗条锈性机制奠定基础。通过研究取得了以下主要结果:1.利用荧光显微技术、微分干涉技术和电镜技术揭示了小麦品种水源11抗锈性表达过程中的组织学和超微结构特征。结果表明,亲和与非亲和组合中,条锈菌扩展及寄主细胞对条锈菌的侵染,在组织学和超微结构上均表现出明显差异。组织学水平上,非亲和组合表现为菌丝生长受抑,菌落发育延迟或败育,吸器母细胞和吸器数目明显减少;同时,侵染点的寄主细胞表现出典型的过敏性坏死症状。在亚细胞水平上,非亲和组合中病菌胞间菌丝、吸器母细胞、吸器也发生了一系列异常变化。其中原生质凝集、液泡程度增加、原生质逐渐消解;胞间菌丝、吸器母细胞细胞壁不规则增厚;细胞器排列紊乱,菌丝逐渐解体;吸器母细胞细胞质最终空泡化后丧失其生理功能。吸器外质膜皱褶,吸器外间质加宽,吸器体最终畸形坏死。同时,寄主细胞产生一系列显著的结构防卫反应:形成胞壁沉积物、乳突、吸器鞘等结构,以及发生坏死,使病菌的发育及扩展显著受抑。2.利用氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium, NBT）和二氨基联苯胺（3,3-diaminobenzidine, DAB）组织化学染色法研究了小麦-条锈菌互作过程中O2-和H2O2产生的时间变化特征和在组织间的定位。非亲和组合中,O2-在接种后12 h左右为产生的高发期,而H2O2产生的高发期大约在接种后12～24 h之间。亲和组合中,绝大多数侵染位点互作早期难以检测到明显的NBT、DAB染色。此外,在侵入前期,两种条锈菌生理小种（CY23和CY31）均可诱导保卫细胞中H2O2的积累。接种后48 h内,O2-和H2O2基本上是在与条锈菌初生吸器母细胞相接触的叶肉细胞中产生;随着时间点的推移,O2-也可以在侵染点处坏死寄主细胞周围的叶肉细胞中产生,而H2O2在坏死寄主叶肉细胞及周围叶肉细胞中均可以检测到。Evans Blue染色后发现,寄主细胞过敏性坏死反应发生的时间大约在接种后16～20 h,这一时间要晚于O2-和H2O2开始产生的时间。试验表明,O2-和H2O2的产生和积累与寄主细胞过敏性坏死有着密切关系,在过敏性坏死反应的发生中可能起着重要作用。3.采用生化测定的方法对活性氧迸发与相关酶活的变化关系进行了研究。非亲和组合中O2-和H2O2的含量要高于亲和组合的;SOD在亲和组合中的活性总体上要高于非亲和组合的;接种24 h后,CAT在两种组合中的活性均高于对照,在接种后36 h和48 h时,亲和组合中的CAT活性高于非亲和组合的,而在接种60 h后又开始低于非亲和组合的;POD活性在接种24 h后均明显升高,但亲和组合中POD活性增幅大;MDA在非亲和组合中于接种后72 h含量明显上升。结果表明,亲和与非亲和组合中活性氧含量及相关酶活变化都存在明显差异,这些差异与小麦抗锈性的表达可能有密切联系。4.采用细胞化学方法对O2-、H2O2和过氧化物酶的分布进行了亚细胞水平的定位,基本明确了它们的产生部位。O2-在与菌丝或坏死寄主细胞相邻的叶肉细胞的液泡膜、质膜和细胞壁上均有分布,并且以分布在液泡膜上的情况居多;而H2O2多分布在与菌丝或坏死寄主细胞相邻的叶肉细胞的细胞壁和质膜上,少数细胞的液泡膜上及寄主细胞间隙也可有H2O2的分布;部分病原菌细胞壁上也显示有活性氧的分布;过氧化物酶在寄主细胞中存在的主要部位为细胞壁和细胞质膜上。试验表明,O2-、H2O2和过氧化物酶在亲和与非亲和组合中的分布位置基本相似,但不同组合间活性氧及过氧化物酶含量有着明显差异。5.通过使用活性氧清除剂SOD和CAT处理小麦叶片后发现,SOD处理的叶片中,H2O2的含量要大于CAT处理的叶片,且出现过敏性坏死的侵染点的比例明显高于对照;而CAT可在一定程度上降低出现过敏性坏死的侵染点的比例,但不能完全阻止过敏性坏死的发生。说明在小麦与条锈菌互作的体系中,活性氧的产生在过敏性坏死反应的发生中起着重要作用。

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摘要

ABSTRACT

第一章综述

1.1 活性氧的产生

1.1.1 活性氧的种类

1.1.2 活性氧的来源

1.1.3 活性氧产生的机制

1.2 诱导活性氧产生的因素

1.2.1 非生物因素

1.2.2 生物因素

1.3 活性氧在植物抗病反应中的作用

1.3.1 直接杀死入侵病原菌

1.3.2 增强细胞壁的结构强度

1.3.3 诱导植保素的合成

1.3.4 诱导过敏性反应

1.3.5 诱导系统获得抗性

1.3.6 诱导防卫基因表达

1.4 活性氧在植物抗病过程中的信号传导

1.5 活性氧的清除系统

1.5.1 保护酶系

1.5.2 抗氧化物质

1.6 小麦条锈病研究概述

1.6.1 小麦条锈病的危害

1.6.2 小麦条锈病的研究现状

1.7 禾谷类锈菌与寄主互作的组织病理学和细胞学

1.7.1 禾谷类锈菌与寄主互作的组织病理学

1.7.2 禾谷类锈菌与寄主互作的细胞学

1.8 本研究的目的、意义

第二章小麦－条锈菌亲和与非亲和组合的组织学及超微结构研究

2.1 材料与方法

2.1.1 供试菌种和小麦品种

2.1.2 条锈菌侵染过程观测

2.1.3 透射电镜样品的制备

2.2 结果与分析

2.2.1 小麦与条锈菌不同组合中的组织学差异

2.2.2 病菌与寄主细胞的超微结构变化

2.3 讨论

2^-和H₂O₂）积累的组织化学研究..'>第三章小麦－条锈菌亲和与非亲和互作中活性氧（O₂^-和H₂O₂）积累的组织化学研究..

3.1 材料与方法

3.1.1 供试菌种和小麦品种

2O₂ 的组织化学定位'>3.1.2 H₂O₂的组织化学定位

2^-的组织化学定位'>3.1.3 O₂^-的组织化学定位

3.1.4 对过敏性坏死细胞的定位

3.2 结果与分析

2O₂ 的积累'>3.2.1 亲和与非亲和互作中的H₂O₂的积累

2^-的积累'>3.2.2 亲和与非亲和互作中的O₂^-的积累

3.2.3 细胞坏死

3.3 讨论

第四章小麦－条锈菌互作过程中活性氧及保护酶系的变化研究

4.1 材料与方法

4.1.1 供试菌种和小麦品种

4.1.2 活性氧及保护酶系测定方法

4.2 结果与分析

4.2.1 小麦与条锈菌不同组合中活性氧的变化

4.2.2 小麦与条锈菌不同组合中保护酶系的变化

4.3 讨论

2^-和H₂O₂）及过氧化物酶的细胞化学研究'>第五章小麦－条锈菌互作过程中活性氧（O₂^-和H₂O₂）及过氧化物酶的细胞化学研究

5.1 材料与方法

5.1.1 供试菌种和小麦品种

2^-细胞化学学定位'>5.1.2 O₂^-细胞化学学定位

5.2 结果与分析

2^-细胞化学学定位'>5.2.1 O₂^-细胞化学学定位

2O₂ 细胞化学学定位'>5.2.2 H₂O₂细胞化学学定位

5.2.3 POD 细胞化学学定位

5.3 讨论

2^-、H₂O₂积累及过敏性坏死发生的影响'>第六章活性氧清除剂处理后对O₂^-、H₂O₂积累及过敏性坏死发生的影响

6.1 材料与方法

6.1.1 供试菌种和小麦品种

6.1.2 供试清除剂

6.1.3 清除剂处理后对NBT、DAB 染色的检测

6.1.4 清除剂处理后对HR 发生的检测

6.2 结果与分析

2^-积累的影响'>6.2.1 清除剂处理后对O₂^-积累的影响

2O₂ 积累的影响'>6.2.2 清除剂处理后对H₂O₂积累的影响

6.2.3 清除剂处理后对HR 发生的影响

6.3 讨论

结论

参考文献

致谢

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