嗜热厌氧杆菌工程菌（Δldh）的构建及其廉价生物质乙醇发酵的研究

论文摘要

由于石油的过度消耗,地球正面临石油资源日益枯竭、原油价格不断攀升、温室气体进一步提高的境况。“低碳经济”正在世界范围内进一步强化实施,加上人们对绿色生物基产品的偏爱,利用产乙醇菌代谢生物质资源转化为乙醇的微生物发酵法日益受到关注。嗜热厌氧杆菌能够代谢生物质中的大部分糖产乙醇而受到推崇,为继续提高其乙醇发酵特性,本课题采用同源重组的方式,沉默了其主要的枝路乳酸脱氢酶,敲除了乳酸代谢途径基因,构建了嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh,采用纤维床反应器（Fibrous bed bioreactor）固定化Δldh突变株发酵木薯渣和甘蔗渣廉价生物质,发展生物发酵法生产燃料乙醇的新工艺。以长期外加乙醇胁迫的方式,提高了Δldh突变株的乙醇耐受性,增强了乙醇发酵能力。基于乳酸脱氢酶序列JW/SL-YS485-AY 278026设计上下游同源片段的引物,以嗜热厌氧杆菌基因组为模板,成功扩增到了乳酸脱氢酶俩同源片段（ldh-up和ldh-down）。以pBLUESCRIPT II SK（+）为基础质粒,化学合成耐热的红霉素抗性基因为筛选标记,把同源片段分别连接在抗性标记的上下游,成功构建打靶载体。对已经用异烟肼弱化了细胞壁的嗜热厌氧杆菌,进行电转化,分别通过PCR验证、Southern Blot验证以及摇瓶发酵实验验证筛选得到了一株嗜热厌氧代谢工程突变株Δldh,PCR实验和Southern Blot实验结果都得到了与预期大小一致的条带,并且摇瓶发酵实验发酵液中没有检测到乳酸的产生,表明红霉素抗性基因已经成功的插入到嗜热厌氧杆菌基因组,Δldh为目的工程菌株。嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh能代谢除蔗糖外的大多数碳源如:葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、木薯淀粉、纤维二糖等。在摇瓶发酵的模式下,60 g/L的碳源没有发现明显的底物抑制现象,对影响乙醇发酵的几个重要参数作了摸索,其较适的发酵条件为:温度45-60℃,pH 5.5-7.5,3 g/L的酵母抽提物,1 g/L的一水半胱氨酸盐酸盐,可以不加二盐酸吡哆胺,初始充氮气压力为0.02 MPa,接种量为10%;进一步研究乙酸钾对嗜热厌氧杆菌乙醇发酵的影响,在摇瓶发酵的模式下,以葡萄糖和木糖为底物,乙酸钾浓度为100 mmol/L时,相比较与没有添加乙酸钾,野生菌细胞干重提高了10.91%15.98%,乙醇浓度降低了39.86%51.51%,乳酸浓度提高了48.61%91.39%。乙酸钾浓度为70 mmol/L时,相比较与没有添加乙酸钾,Δldh突变株细胞干重提高了3.59%6.12%,乙醇浓度提高了5.62%12.63%,没有检测到乳酸的生成。在5 L罐游离细胞间歇一次性补料发酵模式下,分别以葡萄糖、木糖和葡萄糖/木糖（2:1）为碳源,野生菌乙醇的终浓度维持在7.047.98 g/L,得率维持在0.110.12,乳酸浓度维持在30.9136.39 g/L。突变株Δldh乙醇的终浓度维持在17.7825.93 g/L,乙醇得率维持在0.250.32 g/g,检测到少量的乳酸产生2.022.26 g/L。甘蔗渣超微粉碎后,经纤维素酶酶解用于乙醇发酵。在加酶量为55 FPU/g,粉碎时间为40 min,氨水浸泡36 h的甘蔗渣酶解36 h后,葡萄糖和木糖得率分别达到71.93±1.43%和58.46±1.28%。Δldh突变株分步糖化发酵加酶量为50 FPU/g、底物浓度为4%时,葡萄糖和木糖的酶解效率最高分别为71.98±1.13%和59.82±1.21%,葡萄糖和木糖浓度分别为10.85±0.12 g/L和5.264±0.098 g/L。50 mL的血清瓶中发酵,在24 h内水解液中葡萄糖和木糖基本消耗完毕,此时乙醇和乙酸浓度分别为:4.65±0.098 g/L和3.023±0.12 g/L。Δldh突变株同步糖化共发酵在底物浓度为4%、加酶量为50 FPU/g、发酵温度为48℃、pH为6时,乙醇浓度最高为4.38±0.14 g/L。乙醇得率维持在0.110.12 g/g（乙醇/甘蔗渣）。木薯淀粉和木薯渣经稀酸水解预处理,稀酸水解木薯淀粉的葡萄糖得率为90.7%,木薯渣常压稀酸水解的总还原糖得率为54.86%。在FBB固定化Δldh突变株间歇一次性补料的模式下,以葡萄糖和木糖为底物时,乙醇浓度分别为38.26 g/L和34.13 g/L,乙醇得率分别为0.364 g/g和0.342 g/g。以木薯淀粉稀酸水解液和木薯渣稀酸水解液为底物时,乙醇浓度分别为35.82 g/L和39.09 g/L,乙醇得率分别为0.325 g/g（乙醇/木薯淀粉）和0.123 g/g（乙醇/木薯渣）。对Δldh突变株外加乙醇长期胁迫驯化,经过连续转接153次、123天后,嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh酒精耐受性从原来的2.5%（v/v）提高到5.0%（v/v）,驯化菌命名为ET6。在外加乙醇浓度为30 g/L时,驯化菌的比生长速率和乙醇生产效率分别维持在69.44%和50%,而原始突变株Δldh的生长则已经完全受到了抑制。以葡萄糖为底物,FBB固定化驯化菌ET6间歇一次性补料的模式下,发酵液含乙醇47.25 g/L,乙醇得率为0.344 g/g。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 引言

1.2 乙醇发酵

1.2.1 乙醇概述

1.2.2 生物燃料乙醇生产的原料

1.2.3 乙醇发酵微生物

1.2.4 乙醇糖化发酵工艺

1.2.5 代谢途径

1.2.6 产物抑制

1.3 基因敲除技术在代谢工程中的应用

1.3.1 基因敲除

1.3.2 敲除策略的选择

1.3.3 DNA 转化技术和重组细胞的筛选

1.4 细胞固定化和纤维床反应器

1.4.1 固定化细胞的制备方法

1.4.2 固定化细胞生物反应器的主要类型

1.4.3 纤维床反应器

1.5 本课题的目的意义和主要研究内容

1.5.1 研究意义

1.5.2 课题来源

1.5.3 本课题的研究内容和研究思路

第二章嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh的构建、筛选和鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验载体和菌株

2.2.2 仪器与试剂

2.2.3 培养基

2.2.4 实验方法

2.2.5 分析测定方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 染色体基因组的提取

2.3.2 Ldh-up 片段的PCR 扩增及克隆

2.3.3 Ldh-down 片段的PCR 扩增及克隆

aph 片段的PCR 扩增和克隆'>2.3.4 P_aph 片段的PCR 扩增和克隆

2.3.5 电转化实验和PCR 初筛

2.3.6 Southern blot 实验

2.3.7 Δldh 突变株摇瓶发酵产物分析

2.3.8 工程菌Δldh 的稳定性考察

2.4 本章小结

第三章嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh发酵特性的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验菌株

3.2.2 仪器与试剂

3.2.3 培养基

3.2.4 实验方法

3.2.5 分析测定方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 Δldh 突变株生长曲线、温度和pH 的考察

3.3.2 底物广泛性研究

3.3.3 不同底物浓度的研究

3.3.4 不同酵母抽提物浓度的研究

3.3.5 添加一水半胱氨酸盐酸盐对发酵的研究

3.3.6 添加二盐酸吡哆胺对发酵的研究

3.3.7 不同初始细胞浓度（接种量）的研究

3.3.8 不同初始压力的研究

3.3.9 添加乙酸钾对发酵的研究

3.3.10 5L 罐不同底物补料分批发酵的研究

3.4 本章小结

第四章嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh发酵甘蔗渣酶解液产乙醇的研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验菌株和培养基

4.2.2 甘蔗渣

4.2.3 纤维素酶

4.2.4 仪器设备和试剂

4.2.5 实验方法

4.2.6 分析测定方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 甘蔗渣超微粉碎时间的考察

4.3.2 甘蔗渣预处理的考察

4.3.3 分步糖化发酵甘蔗渣产乙醇

4.3.4 同步糖化发酵甘蔗渣产乙醇

4.4 本章小结

第五章嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh发酵木薯淀粉和木薯渣水解液产乙醇的研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验菌株和培养基

5.2.2 种子液的制备

5.2.3 木薯淀粉和木薯渣

5.2.4 仪器设备和试剂

5.2.5 实验方法

5.2.6 分析测定方法

5.3 结果与分析

5.3.1 木薯渣稀酸水解工艺

5.3.2 以葡萄糖和木糖为底物的发酵动力学研究

5.3.3 以木薯淀粉水解液为底物的发酵动力学研究

5.3.4 以木薯渣水解液为底物的发酵动力学研究

5.3.5 反复批次发酵木薯渣水解液生产乙醇的研究

5.4 本章小结

第六章嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh乙醇耐受性驯化

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验菌株和培养基

6.2.2 种子液的制备

6.2.3 仪器设备和试剂

6.2.4 实验方法

6.2.5 分析测定方法

6.3 结果与分析

6.3.1 乙醇耐受性考察

6.3.2 乙醇耐受性驯化

6.3.3 嗜热厌氧代谢工程菌乙醇耐受性变化

6.3.4 驯化菌FBB 反应器中发酵产乙醇的研究

6.4 本章小结

结论与展望

结论

论文创新性

展望

参考文献

附录

攻读博士期间取得的研究成果

致谢

附件

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