基于SSUrRNA序列的熊蜂病原性微孢子虫分析

论文摘要

微孢子虫是专性细胞内寄生的病原微生物,寄主范围包括脊椎动物和无脊椎动物。熊蜂是我国主要的设施农业授粉昆虫,但其主要病虫害微孢子虫病原分布和流行情况还未深入研究。关于微孢子虫种的特征和相同种的遗传变异研究的经典方法都是利用核糖体RNA （rRNA）基因序列。已知多个属的微孢子虫感染昆虫寄主,并且不同寄主发现有不同的微孢子虫种。基于这种情况,不同熊蜂种也可能被不同微孢子虫感染,而不只是目前已知的只有熊蜂微孢子虫Nosema bombi。基于SSUrRNA序列的测定、PCR-RFLP分析和二级结构构建,本研究对来自我国不同地区熊蜂的病原性微孢子虫进行分析。结果如下：（1）微孢子虫广泛感染熊蜂。所调查的甘肃、青海、四川、内蒙古四地均发现微孢子虫感染,检测的26种1008只熊蜂,感染微孢子虫的有16种210只,感染率为20.8%。白背熊蜂Bombus festivus和西伯熊蜂Bombus sibiricus的微孢子虫感染率最高,分别为75.0%和68.6%。红束熊蜂Bombus rufofasciatus的感染率最低,为1.9%。内蒙古地区熊蜂微孢子虫的感染率最高,为50.0%；四川次之,为22.9%；甘肃与青海地区的熊蜂的微孢子虫感染率最低,分别为2.1%和7.7%。（2）我国熊蜂受到来自异源寄主的微孢子虫的感染。感染熊蜂的微孢子虫除了熊蜂微孢子虫Nosema bombi外,还有东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae和早期发现于鳞翅目卷叶蛾科寄主上的微孢子虫Nosema thomsoni相似的微孢子虫。（3）基于PCR-RFLP技术可鉴定感染蜜蜂及熊蜂的微孢子虫种类。使用限制性内切酶AfaⅠ对引物SSUrRNA-f1/SSUrRNA-rlb PCR扩增的微孢子虫部分SSUrRNA基因序列进行酶切,产物经过琼脂糖电泳分析确定微孢子虫种类。（4） SSUrRNA序列比对、系统发育树构建、二级结构分析结果显示感染熊蜂的微孢子虫都属于Nosema属,与以家蚕微孢子虫为代表的真微孢子虫‘’ture Nosema"相区分。来自熊蜂寄主的微孢子虫存在多样性。其中,发现于熊蜂的东方蜜蜂微孢子虫N.ceranae与蜜蜂寄主上的相似性大于99%,并且存在相同的1264 bp的SSUrRNA序列第116个碱基后插入GATT序列的现象。N.bombi A和N. thomsoni A分别与已报道的N.bombi （GenBank登录号：AY008373）和N.thomsoni （GenBank登录号：EU219086）有高度相似性,大于99%。另外,Nosema sp.-1与N.bombi A.的相似性约为97.1%,Nosema sp.-2与N. thomsoni A相比存在14个碱基的差异,Nosema sp.-1与Nosema sp.-2分别是N.bombi和N. thomsoni的近缘种。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 微孢子虫的起源与进化
• 1.2.2 微孢子虫的分类
• 1.2.3 微孢子虫生物学研究
• 1.2.4 蜜蜂及熊蜂微孢子虫研究概况
• 1.3 本研究的内容
• 1.3.1 熊蜂微孢子虫感染情况的调查
• 1.3.2 感染熊蜂的微孢子虫种类鉴定
• 1.3.3 感染熊蜂的微孢子虫PCR-RFLP分析
• 1.3.4 感染熊蜂的微孢子虫SSUrRNA全序列分析
• 第二章 熊蜂微孢子虫感染情况的调查
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器设备及试剂
• 2.1.2 熊蜂样本采集及种类鉴定
• 2.1.3 熊蜂样品处理和微孢子虫DNA提取
• 2.1.4 引物设计和PCR扩增
• 2.1.5 数据统计与分析
• 2.2 结果分析
• 2.2.1 微孢子虫特异性引物PCR扩增结果
• 2.2.2 不同种熊蜂微孢子虫感染情况
• 2.2.3 同一地区不同种熊蜂的微孢子虫感染情况
• 2.2.4 不同地区熊蜂的微孢子虫感染情况
• 2.3 讨论
• 第三章 感染熊蜂的微孢子虫种类鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器设备及试剂
• 3.1.2 微孢子虫来源及DNA提取
• 3.1.3 微孢子虫SSUrRNA基因部分序列扩增
• 3.1.4 微孢子虫SSUrRNA基因部分序列克隆及测序
• 3.1.5 微孢子虫SSUrRNA基因部分序列分析
• 3.2 结果分析
• 3.2.1 微孢子虫特异性引物PCR扩增结果
• 3.2.2 微孢子虫SSUrRNA基因部分序列测序结果
• 3.2.3 感染熊蜂的微孢子虫种类
• 3.3 讨论
• 第四章 感染熊蜂的微孢子虫PCR-RFLP分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要仪器设备及试剂
• 4.1.2 三种微孢子虫DNA获取
• 4.1.3 三种微孢子虫SSUrRNA基因部分片段AfaⅠ酶切分析
• 4.1.4 不同熊蜂来源的微孢子虫检验及种类鉴定
• 4.2 结果分析
• 4.2.1 微孢子虫特异性引物PCR扩增结果
• 4.2.2 三种微孢子虫SSUrRNA基因部分序列酶切结果
• 4.2.3 不同熊蜂来源的微孢子虫检验及种类鉴定结果
• 4.3 讨论
• 第五章 感染熊蜂的微孢子虫SSUrRNA全序列分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 主要仪器设备及试剂
• 5.1.2 微孢子虫来源
• 5.1.3 微孢子虫SSUrRNA基因全长序列扩增
• 5.1.4 微孢子虫SSUrRNA基因全长序列克隆及测序
• 5.1.5 微孢子虫SSUrRNA基因全长序列分析
• 5.1.6 SSUrRNA二级结构构建
• 5.2 结果分析
• 5.2.1 微孢子虫SSUrRNA基因全长PCR扩增结果
• 5.2.2 不同微孢子虫的SSUrRNA序列
• 5.2.3 基于SSUrRNA序列的系统发育及二级结构分析
• 5.3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历