仿生鲶鱼抗菌肽的克隆、表达与活性检测

论文摘要

抗菌肽是由微生物、植物、动物及人体等产生的具有抗菌能力的短肽类物质,不仅抗菌活性强、抗菌谱广、合成和杀菌速度快,而且不易诱导抗药菌株的产生,有望成为新一代的抗菌制剂。据报道,受伤鲶鱼parasilurus asotus的上皮组织分泌一种有广谱抗菌性却无溶血活性的抗菌肽—Parasin I,研究发现和其它抗菌肽相比,其抗菌能力更强,对革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,真菌均有抑制效果。抗菌肽Parasin I是组蛋白裂解产物,不可能通过cDNA方法从鲶鱼组织细胞中得到基因。本研究采取仿生设计和人工合成的技术路线,人工合成仿生鲶鱼抗菌肽DNA序列,经PCR扩增后得到带有不同限制性酶切位点的序列XH1、XH2、XH3。将此基因克隆至载体pGEX-5X-3,成功构建了三元序列重组质粒。测序验证后转化大肠杆菌BL21（DE3）,于37℃经IPTG诱导,融合蛋白以包涵体形式高效表达。经SDS-PAGE谱带黑度扫描分析表明,融合蛋白可达细菌全蛋白总量的30%。采用低温诱导的方法,使目的融合蛋白在细胞内减速转译,形成可溶性蛋白。确定最佳诱导条件为:温度20℃,诱导10小时。经过超声处理细胞,盐析,CM-52阳离子交换柱等提取、分离、纯化,得到所期望的有抗菌活性的仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A。已提取纯化的目的肽段对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母等微生物进行抑菌试验,结果表明,对大肠杆菌、特别是革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制活性,其中枯草芽孢杆菌对PaH2A最为敏感。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 抗菌肽的分类、作用机理和特点
• 1.1.1 抗菌肽的特点
• 1.1.2 抗菌肽的类别
• 1.1.3 抗菌肽的作用机理及作用特点
• 1.2 抗菌肽的制备方法
• 1.2.1 提取法
• 1.2.2 固相合成法
• 1.2.3 基因工程表达
• 1.3 抗菌肽应用
• 1.3.1 在医药工业中的应用
• 1.3.1.1 抗细菌作用
• 1.3.1.2 抗真菌作用
• 1.3.1.3 抗病毒作用
• 1.3.1.4 抗寄生虫
• 1.3.1.5 抗肿瘤
• 1.3.2 在食品工业中的应用
• 1.3.3 饲料工业
• 1.4 鲇鱼抗菌肽
• 1.4.1 分子量和氨基酸序列分析
• 1.4.2 抗菌和溶血现象
• 1.5 课题研究意义及内容
• 第二章 仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A 编码序列的设计与克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 菌株及质粒
• 2.1.1.2 酶及主要试剂
• 2.1.1.3 主要仪器设备
• 2.1.1.4 培养基和培养条件
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 目的基因的扩增
• 2.1.2.2 回收后的PCR 产物的纯化
• 2.1.2.3 限制性内切酶切作用与连接
• 2.1.2.4 感受态细胞的制备
• 2.1.2.5 一元表达载体的构建
• 2.1.2.6 三元表达载体的构建
• 2.1.2.7 重组载体的验证
• 2.1.2.8 测序
• 2.1.2.9 融合蛋白的分子量鉴定
• 2.1.2.10 质粒的稳定性检验
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 目的序列与相应引物的设计
• 2.2.2 序列XH1、XH2、XH3的PCR扩增结果
• 2.2.3 重组质粒的构建
• 2.2.4 重组质粒的连接与转化
• 2.2.5 重组质粒的鉴定
• 2.2.6 测序结果分析
• 2.2.7 融合蛋白的初步表达
• 2.2.8 融合蛋白在细胞内的存在形式
• 2.2.9 质粒的稳定性检验
• 2.3 本章小结
• 第三章 仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A 低温诱导及提取与纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 菌种
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.1.3 主要仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 蛋白含量测定方法
• 3.1.2.2 SDS-PAGE 凝胶电泳
• 3.1.2.3 菌体破碎前的预处理
• 3.1.2.4 超声波法破碎菌体
• 3.1.2.5 盐析
• 3.1.2.6 融合蛋白的CNBr 切割
• 3.1.2.7 离子交换柱的制备及离子交换柱
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 低温下重组菌诱导条件的研究
• 3.2.1.1 不同诱导温度对融合蛋白在胞内存在形式的影响
• 3.2.1.2 低温条件下不同时间融合蛋白的表达量
• 3.2.2 粗产物的预处理
• 3.2.2.1 蛋白定量
• 3.2.2.2 超声波对细胞破碎的研究
• 3.2.2.2.1 破碎时间对菌体破碎效果的影响
• 3.2.2.2.2 菌悬液浓度对菌体破碎效果的影响
• 3.2.2.2.3 菌悬液体积对破碎效果的影响
• 3.2.2.3 融合蛋白的初步分离
• 3.2.2.4 PaH2A 与融合蛋白肽段的分割
• 3.2.3 PaH2A的初步纯化分离
• 3.3 本章小结
• 第四章 仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A 抗菌活性的测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 检测菌种
• 4.1.1.2 主要仪器
• 4.1.1.3 检测培养基
• 4.1.1.4 指示菌悬液的制备
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 双层平板的制备
• 4.1.2.2 Amp标准溶液
• 4.1.2.3 样品的制备
• 4.1.2.4 空白对照样品的制备
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 PaH2A 对大肠杆菌 BL21（DE3）的抑制
• 4.2.1.1 标准曲线的绘制
• 4.2.1.2 PaH2A 对大肠杆菌的活性检测
• 4.2.2 PaH2A 对枯草芽孢杆菌的抑制
• 4.2.2.1 标准曲线的绘制
• 4.2.2.2 PaH2A 对枯草芽孢杆菌的活性检测
• 4.2.3 PaH2A 对金黄色葡萄球菌的抑制
• 4.2.3.1 标准曲线的绘制
• 4.2.3.2 目的蛋白对金黄色葡萄球菌的活性检测
• 4.2.4 PaH2A 对几种不同菌株抑制效果的比较
• 4.3 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 硕士研究生期间在科学技术期刊上发表的论文
• 致谢
• 附录