柑橘半穿刺线虫不同地理种群形态学、遗传多样性研究及分子检测

论文摘要

柑橘半穿刺线虫（Tylenchulus semipenetrans）引起柑橘慢衰病（citrus slow decline disease）是重要的柑橘病害线虫,广泛分布于世界柑橘产区。柑橘半穿刺线虫在我国广泛分布,危害严重。本研究对不同地理群体的柑橘半穿刺线虫从形态学、交叉接种寄生性到分子生物学几个方面进行了比较和分析,并建立了柑橘半穿刺线虫特异性检测技术。对我国4个省,寄主分别为杉木、柑橘5个地理群体柑橘半穿刺线虫的形态学进行了显微观测。各种群测量值与前人测量数据基本一致,表明柑橘半穿刺线虫种群间虫体形态保守;所有群体中均有发现近末端钝圆,呈棍状,表面呈缢缩状类型。通过室内、野外交叉接种发现,杉木林地的柑橘半穿刺线虫种群可侵染杉木苗根系,但未能侵染柑橘苗根系;柑橘地的柑橘半穿刺线虫可侵染柑橘根系,但未侵染杉木根系,这与前人的结果不一致。首次对采自我国4个省份柑橘或杉木上27个柑橘半穿刺线虫种群的rDNA-ITS进行测序,提交GenBank,获得序列号,丰富了柑橘半穿刺线虫的核酸数据库;经过对我国4个省的27个柑橘半穿刺线虫种群的rDNA-ITS区进行测序和比对分析,结果表明:我国不同地区的柑橘半穿刺线虫的rDNA-ITS序列保守,差异极小,线虫种群间的序列相似性在98.4%以上,序列变异率为01.6%,序列多态性分析表明序列特征上存在差异,具有丰富的多样性;根据序列相似度与系统进化树显示我国柑橘半穿刺线虫的ITS序列与地理位置及寄主无相关性。寄生于杉木或柑橘的柑橘半穿刺线虫种群之间并不能通过rDNA-ITS序列区分是否存在生理小种。本研究根据柑橘半穿刺线虫的rDNA-ITS的序列特征,设计出了一对柑橘半穿刺线虫特异性引物,Ts-SF（正向: 5’- TACCAGGTTGAGCAGAGTTCTT -3’）和Ts-SR （反向: 5’- TCCTACCCTTCCACAGCG–3’）。特异性引物灵敏度高,可扩增出单条柑橘半穿刺线虫二龄线虫的DNA;特异性强及可靠性好,对采自全国4个省份16个不同地区寄生柑橘或杉木的柑橘半穿刺线虫种群均能扩增出特异条带,对非靶标线虫未能扩增出条带;可从改良贝尔曼漏斗法分离的线虫混合群体中检测出单条靶标线虫。本研究建立了柑橘半穿刺线虫特异性检测体系,对柑橘半穿刺线虫的防治具有重要意义和应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 柑橘半穿刺线虫的发生、为害与分布
• 1.2 柑橘半穿刺线虫的分类地位、寄主范围与小种分化
• 1.2.1 半穿刺线虫属的主要分类地位、形态特征与描述种
• 1.2.2 柑橘半穿刺线虫的寄主范围及生理小种
• 1.3 柑橘半穿刺线虫的生活史与生物学特性
• 1.4 柑橘半穿刺线虫的防控技术
• 1.4.1 加强检疫，建立无病苗圃
• 1.4.2 栽培管理
• 1.4.3 选用抗性砧木
• 1.4.4 化学防治
• 1.5 植物寄生线虫的分子分类、鉴定及检测
• 1.5.1 植物寄生线虫的形态学分类
• 1.5.2 其他传统的植物寄生线虫的分类学方法
• 1.5.3 植物寄生线虫的分子分类及鉴定
• 1.6 存在问题及本项目研究的目的与意义
• 2 柑橘半穿刺线虫不同地理种群的形态学及寄生性测定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 柑橘半穿刺线虫种群的采集与分离
• 2.1.2 柑橘半穿刺线虫的杀死与固定
• 2.1.3 柑橘半穿刺线虫标本的制作
• 2.1.4 形态学观察及数值测量
• 2.1.5 柑橘半穿刺线虫的交叉接种实验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 为害症状
• 2.2.2 柑橘半穿刺线虫基本形态
• 2.2.3 不同种群形态学测量
• 2.2.4 接种实验
• 2.3 讨论
• 2.3.1 柑橘半穿刺线虫形态比较
• 2.3.2 柑橘半穿刺线虫在柑橘、杉木上的交叉接种寄生性
• 3 柑橘半穿刺线虫种群rDNA 多态性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试柑橘半穿刺线虫种群
• 3.1.2 主要试剂与仪器
• 3.1.3 溶液配制
• 3.1.4 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 3.1.5 线虫的分离与线虫DNA 的提取
• 3.1.6 引物合成与设计
• 3.1.7 ITS 序列的PCR 扩增
• 3.1.8 PCR 产物克隆与测序
• 3.1.9 序列分析与ITS 区引物设计、提交、登录
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 柑橘半穿刺线虫rDNA-ITS 扩增
• 3.2.2 序列分析
• 3.2.3 柑橘半穿刺线虫rDNA-ITS 区引物设计
• 3.2.4 柑橘半穿刺线虫rDNA-ITS 区特异性引物扩增结果
• 3.2.5 柑橘半穿刺线虫ITS 序列的特征及其多态性
• 3.2.6 柑橘半穿刺线虫基于ITS 序列种群间的相似性
• 3.2.7 半穿刺线虫ITS 区的分子系统树的构建
• 3.3 小结与讨论
• 4 柑橘半穿刺线虫特异性引物设计与检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂及仪器
• 4.1.2 序列分析及引物设计
• 4.1.3 引物的灵敏性、特异性及可靠性的研究
• 4.1.4 特异性引物从土壤直接检测半穿刺线虫灵敏性、可靠性研究
• 4.2 结果
• 4.2.1 特异性引物
• 4.2.2 单条线虫的检测
• 4.2.3 不同龄期线虫的检测
• 4.2.4 对非靶标线虫的检测
• 4.2.5 对柑橘半穿刺线虫不同种群的特异性检测
• 4.2.6 特异性引物从土壤直接检测半穿刺线虫灵敏性、可靠性
• 4.3 讨论
• 5 本研究的主要结论与创新点
• 5.1 柑橘半穿刺线虫不同地理种群的形态学
• 5.2 柑橘半穿刺线虫在柑橘、杉木上的交叉接种寄生性
• 5.3 柑橘半穿刺线虫种群rDNA 多态性分析
• 5.4 建立我国柑橘半穿刺线虫特异性检测技术
• 参考文献
• 附录A 27 个半穿刺线虫种群的ITS 序列比对结果
• 附录B 供试27 个半穿刺线虫rDNA 相似性矩阵分析
• 附录C 攻硕期间所发表的相关文章
• 附录D 缩写词及英汉对照
• 致谢