褐飞虱对寄主营养恶化及高种群密度的分子应答

论文摘要

褐飞虱（Nilaparavata lugens）是一种重要的水稻害虫,其成虫具有长、短翅型两型现象。自然条件下,水稻营养条件差种群密度增大时易产生长翅型；水稻营养条件良好种群密度较小时易产生短翅型。长翅型迁飞,繁殖力较弱；短翅型发育快,繁殖力强,危害性大,但不能迁飞。研究褐飞虱对寄主营养恶化及高种群密度下的分子应答反应,对揭示褐飞虱灾变的内在原因具有重要意义。本研究通过黄熟期寄主和高虫口密度环境,构建恶化的营养胁迫条件；通过健壮的分蘖期寄主水稻和低虫口密度环境,构建适宜生存条件。比较褐飞虱在两种条件下的基因表达差异,得到褐飞虱环境胁迫应答基因。在NDSC诱导条件（寄主为黄熟期水稻,高虫口密度）和NRCC诱导条件（寄主为分蘖期水稻,低虫口密度）下,分别得到两组虫样,每组虫样从2龄到5龄取了8个时间段的样品,通过分析其在不同条件下表达谱差异,揭示其其对不良营养条件的分子应答机制。主要研究结果如下：1、褐飞虱转录组测序分析：通过Solexa法对褐飞虱转录组测序,共测得1,682,583,750个碱基对,组装后共得到76406条Unigene。将Unigene序列与蛋白数据库NR、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对,得到了Unigene功能注释,并进行转录组COG与GO功能分类。此外,转录组测序分析还做了Unigene的KEGG代谢通路分析,预测编码蛋白框（CDS）分析。褐飞虱转录组测序分析完成了转录水平上大规模的基因测序,为褐飞虱差异表达谱测序分析提供了参考序列。2、褐飞虱差异表达谱测序分析：我们对ND3.2（即在NDSC条件下3龄第2天）和NR3.2（在NRCC条件下3龄第2天）若虫文库测序。测序后分别产生了290万和300万的clean tag,这其中又分别有71672和83592个差异clean tag。将clean tag与参考基因数据库对比,对其中唯一比对到一个基因的clean tag进行基因注释,同时获得标准化的基因表达量。由此从ND3.2和NR3.2两个文库中共筛选出1203个上调基因和1341个下调基因。3、选取了脂质代谢、糖类代谢、氨基酸代谢、翅发育及肌肉发育途径、激素代谢、卵巢发育途径,共6类与环境胁迫有密切关系的基因,从表达谱中筛选出这6类差异表达基因,基因数分别为58、34、58、15、7、8个,共计180个统计了这些基因在每个类别中的差异表达情况。根据相对差异较大和表达量较高的标准又从这6类中分别选择了6、2、3、3、3、2个,共计19个基因。4、对这19个基因进行real-time PCR验证,分别得到了这些基因在NDSC和NRCC条件下不同龄期中的基因差异表达情况。实验结果显示差异表达结果与表达谱分析基本相符。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 褐飞虱的危害及特点
• 1.2 寄主营养条件对昆虫生长发育的影响
• 1.3 种群密度对昆虫生长发育的影响
• 1.4 寄主营养条件对昆虫翅型的影响
• 1.5 种群密度对昆虫翅型的影响
• 1.6 环境胁迫条件对昆虫生理生化特性及代谢的影响
• 1.7 环境胁迫条件对昆虫分子特性的影响
• 1.8 Solexa测序技术的概况
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 主要试剂耗材
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 褐飞虱胁迫处理及对照
• 2.2.2 trizol法抽提总RNA
• 2.2.2.1 试验材料预处理
• 2.2.2.2 抽提褐飞虱总RNA
• 2.2.2.3 RNA琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.2.4 总RNA的浓度测定
• 2.2.3 褐飞虱转录组分析
• 2.2.4 褐飞虱表达谱分析方法
• 2.2.5 褐飞虱总RNA的反转录
• 2.2.6 差异表达基因的选择
• 2.2.7 实时荧光定量PCR（real-time PCR）
• 3 实验结果
• 3.1 褐飞虱若虫总RNA抽提结果
• 3.2 总RNA的浓度测定
• 3.3 转录组结果
• 3.3.1 测序产生序列的基本信息
• 3.3.2 Unigene的长度分布及匹配度
• 3.3.3 gap占Unigene长度百分比统计
• 3.3.4 Unigene在nr数据库中同源性比对相似度情况
• 3.3.5 Unigene的GO分类
• 3.3.6 Unigene的COG分类
• 3.4 表达谱结果
• 3.4.1 褐飞虱差异表达谱产生的tag数据
• 3.4.2 总clean tag数和差异表达clean tag数在不同丰富度上的分布
• 3.4.3 差异表达基因的GO功能分类
• 3.4.4 褐飞虱在环境胁迫条件下差异表达基因的选择
• 3.5 褐飞虱总RNA的反转录
• 3.6 差异表达基因的real-time PCR结果
• 4 讨论
• 4.1 褐飞虱总RNA的抽提
• 4.2 转录组结果
• 4.3 表达谱结果
• 4.4 反转录结果
• 4.5 real-time PCR验证
• 参考文献
• 致谢