论文摘要
背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等,病理以黑质多巴胺能神经元的丧失和路易氏小体（Lewy Body）的形成为特点。约lO—15%的PD患者有家族史,常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（autosomal recessive-early-onset parkinsonism, AREP）是指是指除符合帕金森病临床诊断标准以外,遗传方式呈常染色体隐性遗传,发病年龄≤45岁的帕金森综合征,其发病可能与Parkin基因,PINK1基因,DJ-J,基因等突变有关。国内外研究者对parkin基因进行突变分析,除点突变、小片段缺失或/和插入突变、剪切位点突变以外,还发现parkin基因存在外显子重排突变。对于呈杂合状态的外显子缺失突变及杂合或纯合状态的重复突变, DNA直接测序不能检出。为全面检测parkin基因突变,目前国外普遍采用荧光定量PCR技术结合DNA直接测序技术对parkin基因进行突变检测。目前国内仅有郭纪锋等用荧光半定量法结合DNA直接测序对parkin基因进行突变检测的报道,尚未报道有人用实时荧光定量PCR技术检测parkin基因突变,现采用实时荧光定量PCR法对parkin基因重排突变热点区域—第2、3、4号进行检测。目的建立应用实时荧光定量PcR检测parkin基因外显子重排突变的技术平台,结合DNA直接测序方法对本组21个AREP家系先证者进行parkin基因突变分析。验证荧光半定量法检测parkin基因重排的有效性及敏感度。方法采用实时荧光定量PcR技术检测parkin基因外显子重排突变,结合DNA直接测序方法检测parkin基因点突变、小片段插入或/和缺失突变。设置beta globin基因为内对照,建立parkin基因和6etaglobin基因的标准曲线,根据已建立的标准曲线计算parkin基因和betaglobin基因相对于标准品的起始拷贝数比率,parkin基因相对比值为parkin基因相对起始拷贝数与beta globin基因相对起始拷贝数的比值。结果应用实时荧光定量PcR技术对21个AREP家系先证者进行parkin基因外显子重排突变检测,发现并验证了荧光半定量法检测出的lO个parkin基因第2、3、4号外显子重排（杂合及纯合缺失）,并发现另外存在的1个杂合缺失,1个纯合缺失,在新增的患者中发现l例3号外显子重复。发现parkin基因正常外显子相对拷贝数比值均在0.8-1.2之间,杂合缺失相对拷贝数比在O.4-O.6之间。重复突变相对拷贝数比值)1.4,纯合缺失<0.1,均在目前公认的正常参考范围之内。结论建立应用实时荧光定量PCR检测parkin基因外显子重排突变的技术平台,并运用实时荧光定量PCR技术再次验证了郭纪锋博士的荧光半定量法结果,同时发现另外parkin基因外显子1个杂合缺失、1个纯合缺失和1个重复,提示实时荧光定量PCR法以gDNA为模板检测外显子重排具有很高的灵敏度和可靠性。发现了本组新增患者parkin基因第4号外显子存在的2个单核苷酸多态:纯合c.500G—A,杂合c.500G—A,均为己报道SNP。