论文摘要
氧是维持人类生命活动所必须的基本物质之一。缺氧是高原病的直接原因,也是多种疾病发生和发展的过程中常见的病理生理过程。急性和慢性缺氧均可以导致缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH),后者病理生理基础是肺动脉的收缩反应增强和血管壁结构改建(remodeling)。对于Ca2+与缺氧性肺血管收缩的关系已经进行了大量研究。目前认为,缺氧时线粒体电子传递降低,电压门控K+通道(Kv通道)周围活性氧水平发生改变,使Kv通道受抑制(特别是Kv1.5和Kv2.1),导致膜电位降低,Ca2+内流增加,从而引起肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)收缩,进而导致肺动脉压升高。但是细胞内Ca2+稳态失衡与肺血管结构改建的关系尚不明确,特别是Ca2+信号转导中哪些环节起主要调节作用还不清楚。从本质上说,肺血管结构改建是缺氧作用下肺血管进行一系列基因表达重新调整,进而其结构、功能、代谢发生重新调重的结果。证据表明,缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是介导机体对缺氧发生基因表达重新调整的中心环节。最早在1992年发现HIF-1,随后相继发现了HIF-2、3、4,它们是分别由不同的α亚基和相同的β亚基构成的异二聚。众多的研究证明HIF参与HPH的发生发展过程,可能主要从下述两方面发挥作用:1)增加缩血管物质的生成,减少扩血管物质的生成;2)促进肺动脉的重构。但是各家研究结果并不一致,很多环节尚待阐明。既然Ca2+稳态失衡和HIF水平改变分别是细胞对缺氧发生反应在细胞信号转导和转录调节水平的两个关键环节,那么有理由推测二者之间可能存在密切关系,共同参与细胞对缺氧反应的调节。本研究在PASMCs缺氧模型上,研究HIF表达的时相特点,应用Ca2+信号转导不同环节的工具药物,探讨Ca2+信号通路如何参与缺氧性PASMCs增殖,并初步探讨钙信号是否与HIF-2α有一定关联。方法:组织块法培养肺动脉平滑肌细胞,细胞长到一定数量时,分为常氧组和缺氧组,应用MTT检测细胞活性,初步判断6 h、12 h、24 h、48 h中哪个为检测细胞增殖的最佳时间点。为了观察钙信号通路与缺氧诱导的PASMCs增殖的关系,将细胞同步化后分成常氧组、缺氧组、缺氧+ L-型钙通道阻滞剂硝苯吡啶(nifedipine, NFD 10μM)组、缺氧+钙调素拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine, TFP 10μM)组、缺氧+核转录因子NF–κB抑制剂PDTC (20μM)组、缺氧+细胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM (20μM)组,缺氧及其缺氧加药组放入2%氧浓度的缺氧培养,一段时间后,取出细胞进行各组细胞MTT检测活性,流式细胞术分析细胞周期分布,免疫荧光检测PCNA表达。为了研究PASMCs的HIF的时相表达特点,当细胞长到一定数量时,去血清同步化处理,分为常氧组和缺氧组,分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后取出,提取RNA和蛋白,用RT-PCR方法检测各组HIF-1α、HIF-2α、HIF-βmRNA表达,Western blot检测其个时间点的蛋白表达。细胞同步化处理后,分为常氧组和缺氧组,各组内再分别设对照组、NFP (10μM)组、T-型钙通道阻滞剂盐酸阿米洛利(amiloride hydrochaeridae,100μM)组、BAPTA/AM (15μM)组以及TFP (7.5μM)组,培养24 h后,检测各个工具药物对于HIF-2α表达的影响,以初步确定钙信号通路与HIF的关系。结论:1.MTT检测细胞活性,细胞缺氧后与常氧组相比活性可见不同程度增高,但是在缺氧12 h时,缺氧和常氧组的差异最明显,所以选择12 h为检测工具药的作用时间点。2.MTT检测结果显示,与常氧组相比,2%氧浓度培养PASMCs 12 h,细胞活力增加。L-型钙通道阻滞剂、细胞内Ca2+螯合剂、CaM拮抗剂和NF-κB抑制剂等各加药组细胞活力与缺氧组相比均受到不同程度的抑制,其中NFD、BAPTA和PDTC各组细胞活力接近常氧组的水平(与常氧组相比),而TFP组细胞活力降低最为显著,且与常氧组相比细胞活力显著降低。3.流式细胞测定结果显示,与常氧对照组相比,缺氧组G0/G1期细胞比例显著降低,S和G2/M期细胞比例均显著增加。根据公式细胞增殖指数(proliferation index): PI= (S+G2/M)/ (S+G2/M+G0/G1)计算结果显示,缺氧状态下PI比常氧组增加了约1.46倍(P<0.01),L-型钙通道阻滞剂、细胞内Ca2+螯合剂、CaM拮抗剂和NF-κB抑制剂等各工具药物均可显著抑制缺氧诱导的细胞细胞增殖,且各药物刺激组与常氧组相比也均有显著性抑制作用。4.免疫荧光照片可见,2%缺氧组与常氧组相比,荧光强度明显增加,L-型钙通道阻滞剂、细胞内Ca2+螯合剂、CaM拮抗剂和NF-κB抑制剂均可显著抑制缺氧诱导的细胞PCNA的表达量。5.图像分析显示缺氧对于HIF-1/2α、HIF-β的mRNA表达未见受缺氧和培养时间影响。常氧条件各时间点mRNA的表达量与在缺氧对应条件时间点下的表达量未见显著差异,而且缺氧和常氧各自时间点间的表达差异也未见统计学差异。6.常氧条件下,仅有微量HIF-1α蛋白表达,但因表达量很低无法进行统计分析。缺氧后,HIF-1α表达量大幅度增加,大约在48 h达到高峰,继续培养72 h,表达量急剧下降。常氧条件下,HIF-2α蛋白就有少量表达,缺氧后表达量迅速达高峰,且其在缺氧12 h、24 h、48 h、72 h各个时间点表达量未见显著差异。HIF-β无论是在缺氧还是在常氧条件下均可见大量表达,且表达量不随培养时间的延长而改变;常氧和缺氧各个对应时间点之间其条带的灰度值虽然有一定浮动,但是其差异也未见统计学显著性。7.常氧条件下,NFP、Amiloride、BAPTA/AM、CaM抑制剂TFP对于HIF-2αmRNA的表达未见显著影响。与缺氧组不加药物组相比,缺氧+Amiloride、缺氧+BAPTA/AM、缺氧+TFP的HIF-2αmRNA的表达呈不同程度的抑制。8.常氧条件下,NFP、Amiloride对HIF-2α的蛋白表达量未见明显抑制作用,而BAPTA/AM、TFP对于HIF-2α的蛋白表达量呈显著抑制作用。与常氧条件下相同,缺氧+BAPTA/AM、缺氧+TFP对于HIF-2α的蛋白表达呈显著的抑制作用,NFP和Amiloride对于低氧条件下的PASMCs HIF-2α的表达影响不明显。结论:1.钙信号参与调节缺氧引起的PASMCs增殖,其中CaM和NF-κB为两个重要的调节点。2.PASMCs的HIF-β的mRNA以及蛋白表达呈固有型表达特点,不受缺氧刺激所影响。3.缺氧刺激后,PASMCs的HIF-1α、HIF-2αmRNA表达量未见显著变化,而蛋白水平大幅度上升,其中HIF-1α蛋白约在48 h达到高峰,然后迅速回降,HIF-2α则在缺氧12 h后即达高峰并维持在高水平。这些结果提示,大鼠PASMC的HIF-1/2α的调控主要在转录后水平,它们对缺氧的反应表现出不同的时相特点。4.缺氧引起PASMCs内钙稳态失衡参与HIF-2α表达调控,其中CaM是重要调节点。
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标签:缺氧论文; 缺氧性肺动脉高压论文; 缺氧诱导因子论文; 肺动脉平滑肌细胞论文;