论文摘要
癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一,探索诊断和治疗癌症的手段是生物学研究的重要任务。转移性和侵袭性是恶性肿瘤的重要特征,与基因和蛋白质水平上的一系列改变密切相关。本实验室前期对涎腺腺样囊性癌（Adenoidcystic carcinoma of salilary gland,SACC）高、低转移细胞系ACC-M和ACC-2的mRNA表达谱比较研究时发现,肿瘤睾丸抗原（Cancer/testis antigen,CTAs）家族成员XAGE-1在ACC-M细胞中有较高表达现象。用RNA干扰降低ACC-M细胞中XAGE-1的表达使得该细胞在体外和体内的转移率下降。该结果提示XAGE-1可能是一种和ACC肿瘤转移密切相关的CTAs。已有报道XAGE-1在尤文肉瘤、黑色素瘤、肺腺癌等肿瘤中有较高表达;其表达受到甲基化调控;在肺癌和前列腺癌患者体内能刺激体液和细胞免疫应答;但功能未知。本论文对XAGE-1在口腔肿瘤中的表达及不同剪接体差异表达机制,在肿瘤细胞生长和转移中的作用、机理和可能的免疫学应用进行了研究。整个研究分为5个部分。第一部分利用Real-time PCR和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）方法检测了XAGE-1在口腔肿瘤及部分正常组织中的表达,结果显示XAGE-1四种剪接体在口腔肿瘤中的表达有较大差异,其中1b表达量最高,和1d表达相关联;1a和1c表达量较低;在ACC肿瘤中有较高水平的表达;在淋巴结中天然表达。第二部分我们对XAGE-1上游启动子区域采用荧光素酶报告载体,进行了转录活性分析。结果显示,1b转录本上游片段的转录活性远高于1a上游片段,两个转录本间隔181bp的一段序列可能是造成1a,1b转录活性巨大差异的主要原因;并且1b在肿瘤细胞SPC-A1中的转录活性要高于正常胚胎细胞293T;在ACC-M中的转录活性要高于ACC-2细胞。对XAGE-1四种剪接体进行亚细胞定位研究发现1a,1b,1C都是核内定位,1d为全细胞分布,提示存在XAGE-1特异的核定位信号。第三部分中,我们构建了真核表达XAGE-1b的载体,对该基因影响肿瘤细胞生长和转移进行了研究。发现XAGE-1b过表达可以促进细胞的生长和克隆形成,而XAGE-1b稳定表达细胞株裸鼠皮下移植瘤的生长速度也较对照加快,出现肺转移。稳定干扰XAGE-1b的ACC-M细胞株在体外和裸鼠皮下生长速度减慢,穿膜能力下降。第四部分我们检测了瞬时表达XAGE-1b对ACC-2细胞周期、凋亡的影响。发现XAGE-1b表达使得ACC-2细胞周期G0-G1期减少,G2-M增加;也使得ACC-2细胞对1250u/ml的TNF-α或者血清饥饿诱导凋亡有一定的耐受作用。用Mercury信号通路质粒系统分析,结果显示XAGE-1b表达对RB,CRE,C-Myc,HSE,E2F,GRE,NF-κB因子的反应元件有不同程度的转录激活,对P53,AP1稍有抑制。其中,对RB（P＜0.01）和C-Myc（P＜0.05）的激活作用显著。进一步对C-Myc和RB作浓度梯度实验,结果显示XAGE-1b对C-Myc反应元件的激活呈较好的线性关系,表达质粒300ng时激活作用达到对照组的7倍;而对RB的激活作用较弱,达到饱和浓度时为对照组的2倍。为了进一步弄清ACC-2细胞的免疫遗传学特征,第五部分研究中,我们对ACC-2细胞株进行了HLA（Human Leukocyte Antigen）分型,确定其HLA型别为HLA-A24/68,B72/72,DR1/1。同时建立了一种基于融解曲线分析的快速HLA-DR位点荧光分型方法,为后续XAGE-1的免疫学研究打下基础。综上所述,本论文发现XAGE-1基因在包括ACC肿瘤在内的口腔肿瘤中有表达,在淋巴结中天然表达;XAGE-1b为优势转录本,核定位;证明XAGE-1b具有促进ACC肿瘤细胞生长和转移作用;并从机理上提示XAGE-1b可能对细胞周期、细胞凋亡等重要信号通路发挥转录调控功能。以上结果为XAGE-1相关肿瘤诊断和治疗研究奠定了良好基础,也为CT抗原的转录调控及功能研究提供了新的线索。