抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究

论文摘要

猫人参为华东地区治疗各类消化道肿瘤的习用中草药，是目前本地区抗肿瘤处方中最多用的品种之一。目前中药学及植物学专著多记载其原植物为对萼猕猴桃（又称镊合猕猴桃）（Actinidia valvata Dunn），但民间也有以大籽猕猴桃（A．macrosperma C．F．Liang）为猫人参的原植物，甚至认为后者入药疗效更佳。而且因猫人参用量较大而野生资源有限，时常有同属其它种类如黑蕊猕猴桃（A．melanandra Franch）、小叶猕猴桃（A．lanceolata Dunn）、中华猕猴桃（A．chinensis Planch．）等混用为猫人参，影响了本品的品质和疗效。因此，当务之急首先要确定正品猫人参的原植物，并准确鉴别其与混淆品；其次猫人参的近缘种能否代用，以扩大目前严重紧缺的药源。基于此目的，本文考证了猫人参原植物，系统鉴别了猫人参及其混淆品，研究了猫人参有效部位HPLC图谱与体外抗肿瘤活性，分析比较了猫人参及其混淆品的矿质元素，确认了猫人参猫草反应的化学物质。1、原植物考证通过民间与市场调查、药材性状与原植物形态鉴定、文献查阅，根据原植物形态、药用历史和学名发表时间，明确了正品猫人参的主要来源应为大籽猕猴桃，而对萼猕猴桃可能只是其次要来源。2、种质鉴别从原植物形态、生药性状、荧光反应、紫外光谱、荧光光谱、傅立叶变换红外光谱（FT-IR）、PCR-RFLP等角度系统地鉴别了大籽猕猴桃及其近缘种，尤其是形态相似而一直被认为是猫人参原植物的对萼猕猴桃。大籽猕猴桃与对萼猕猴桃等近缘种的形态差异主要在繁殖器官花果上，因此营养生长期较难鉴别。以生药性状为基础，结合9种猕猴桃生药的蒸馏水、乙醇、氯仿、石油醚提取液在254nm、365nm紫外光激发下的荧光颜色，4种提取液的紫光光谱，水提液和醇提液的荧光光谱，完全、准确鉴别了9种药用猕猴桃，编制了鉴定检索表。9种猕猴桃红外谱图总体较相似，但中华猕猴桃和毛花猕猴桃有强烈末端吸收，明显区别于其它7种猕猴桃，进一步比较大籽猕猴桃等7种猕猴桃与中华猕猴桃红外谱图的相减谱图，完全区分了9种猕猴桃，编制了鉴定检索表。限制性内切酶DdeI、DraI对大籽猕猴桃叶绿体trnK片段的酶切式样具有特异性，建立了大籽猕猴桃的PCR-RFLP分子指纹图谱，可有效鉴别猫人参混淆品的原植物。3、体外抗肿瘤活性比较体外抗肿瘤试验结果表明，大籽猕猴桃对供试的3种肿瘤细胞株均有较强的抑制作用，但敏感性存在差异，抑制效果为肝癌SMMC-7221(IC50=54.22μg／ml)＞胃癌SGC-7901（133.16μg／ml）＞肺癌A549（206.63μg／ml）。大籽猕猴桃和对萼猕猴桃对人肝癌细胞株SMMC-7221抑制活性差异显著，后者（217.85μg／ml）仅为前者的1／4。异色猕猴桃、长叶猕猴桃、毛花猕猴、小叶猕猴桃桃对SMMC-7221的抑制效果均显著优于大籽猕猴桃，尤其是小叶猕猴桃的IC50达到6.53μg／ml，活性相当于大籽猕猴桃的8倍，是本研究的重大发现，值得进一步研究。在人胃癌细胞株SGC-7901、人肺癌细胞株A549试验中，9种供试材料仅大籽猕猴桃和对萼猕猴桃有一定的抑制作用，而且二者活性相当，差异不显著。基于活性分析结果，我们建议在治疗胃癌和肺癌时，大籽猕猴桃和对萼猕猴桃活性接近，均可作猫人参入药，其它种类不宜混用；而治疗肝癌时，大籽猕猴桃的活性明显高于对萼猕猴桃，对萼猕猴桃不宜作猫人参入药，或者至少须用量加倍，验证了富阳草药医认为“白货”对萼猕猴桃药效不及“红货”大籽猕猴桃，需加倍使用的说法。结合HPLC图谱和体外抗肿瘤活性结果，推测猫人参中起抗肿瘤作用的有效组分可能并不是其含量最高的几个成分，而可能是本实验条件下吸收强度较弱、分离度不佳的化合物。本试验的HPLC图谱仍需进一步改进洗脱条件，改善图谱，以更加真实地反映乙酸乙酯部位的化学成分组成。4、矿质元素分析矿质元素（包括微量元素）与有效成分是中药气味的两大物质基础，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定、比较了猫人参及其混淆品和浙江地区常见的其它药用猕猴桃的矿质元素含量。目前公认的与肿瘤发生、发展有关的微量元素有Cu、Zn、Se、Fe。大籽猕猴桃Cu、Zn含量显著高于其它8种猕猴桃，而Se含量较低，Fe含量中等，说明猫人参的抗肿瘤作用还可能与高含量的Cu、Zn有关。基于矿质元素的聚类图（加大了Cu、Fe、Se、Cu的权重）表明，大籽猕猴桃与其它8种猕猴桃均有较大差异，因此从抗肿瘤微量元素含量的角度，其它种类猕猴桃代用大籽猕猴桃作猫人参似乎并不适宜。5、猫草反应研究猫人参引起人们的关注并用于临床治疗癌症，始于其对猫的特异性吸引和嚼食作用，本文采用GC-MS法分析了野生与组培大籽猕猴桃叶片挥发油成分，确定了大籽猕猴桃引起家猫特异性取食现象（猫草反应）的化合物为二氢荆芥内酯、二氢猕猴桃内酯及阿根廷蚁素三种化合物。这三种化合物在野生植株和人工繁殖植株中均存在，且含量相似，推测这是大籽猕猴桃的遗传性状。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究历史与背景
• 1.1 猫人参的临床应用与研究
• 1.1.1 生药学研究
• 1.1.2 临床应用
• 1.1.3 化学成分与药理作用
• 1.2 猕猴桃属植物化学研究
• 1.2.1 猕猴桃属简介
• 1.2.2 猕猴桃属化学成分研究
• 1.2.3 猕猴桃属药理研究
• 1.3 现代分析技术在生药鉴定中的应用
• 1.3.1 现代仪器分析技术在生药鉴定中的应用
• 1.3.2 DNA分子标记技术在药用植物鉴别中的应用
• 1.4 本文的研究目的与研究内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 猫人参原植物考证及其与近缘种的生药学鉴别
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1. 猫人参原植物的考证及形态鉴别
• 2.2.2 生药性状观察
• 2.2.3 荧光反应
• 2.2.4 紫外光谱法
• 2.2.5 荧光光谱法
• 2.3 结论
• 第三章 大籽猕猴桃及其近缘种生药粉末的FT-IR鉴别
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 精密度试验
• 3.2.2 稳定性试验
• 3.2.3 重复性试验
• 3.2.4 大籽猕猴桃与其它猕猴桃的红外谱图差异
• 3.3 讨论
• 第四章 大籽猕猴桃及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 PCR反应条件优化
• 4.2.2 酶切反应
• 4.3 讨论
• 第五章 9种猕猴桃体外抗肿瘤活性的比较研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与制备
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 HPLC图谱
• 5.2.2 卤虫毒性试验
• 5.2.3 体外肿瘤细胞抑制试验
• 5.3 讨论
• 第六章 9种猕猴桃生药材矿质元素的比较
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 样品前处理
• 6.1.3 测定方法
• 6.1.4 统计分析
• 6.2 结果与分析
• 6.3 讨论
• 第七章 大籽猕猴桃挥发油成分及其猫草反应研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 挥发油的提取
• 7.1.3 GC-MS分析
• 7.2 结果与分析
• 7.3 讨论
• 第八章 结果与结论
• 8.1 原植物考证
• 8.2 种质鉴别
• 8.2.1 原植物形态与生药学鉴别
• 8.2.2 生药粉末的FT-IR鉴别
• 8.2.3 PCR-RFLP分子鉴别
• 8.3 体外抗肿瘤活性比较
• 8.4 矿质元素分析
• 8.5 猫草反应研究
• 8.6 未来研究展望
• 参考文献
• 本研究的创新点
• 在读期间的主要科研成果
• 致谢