论文摘要
血小板减少症在临床上较为常见,目前用于救治血小板减少症的药物不仅种类少,而且还存在各种缺点,临床上急需新型、高效升血小板药物。巨核细胞是血小板生成的前体细胞,调控巨核细胞的增殖与分化是促进血小板生成的最有效手段1。血小板生成素（thrombopoietin,TPO）又称巨核细胞生长发育因子（MGDF）或血小板生长因子（TSF）,是巨核细胞-血小板系统最重要的调控因子和促进血小板生成最主要的细胞因子。TPO通过与其受体c-Mpl结合而刺激巨核细胞的增殖与分化,并促进血小板的生成和释放,控制循环血中血小板的数量和功能2。但是,由于通过基因工程制备并经聚乙二醇化的重组人MGDF在临床试用过程中有中和性TPO抗体现象发生,美国FDA至今未批准重组人TPO基因工程产品进入临床。TPO模拟肽（thrombopoietin mimetic peptide,TMP）是一种与天然TPO生物学活性相似但又与其完全不同源的短肽,体外实验显示TMP与巨核细胞表面的TPO受体c-Mpl具有很高的亲和力,体内动物实验未发现其能诱导产生中和性TPO抗体3。但是,由于TMP分子量非常小,不易通过基因工程方法进行制备,同时在血液中也容易被降解,因此使得它在临床上的推广应用受到很大限制。近来研究发现,人生长激素（human growth hormone, hGH）具有显著刺激巨核/巨核祖细胞增殖分化和促进血小板生成的作用4。然而,由于hGH的生物学功能比较广泛,其在促进巨核细胞增殖分化和血小板生成作用时的生物利用度相对较低。为此,我们通过基因重组技术将TMP与hGH进行融合,目的是使hGH在TMP引导下靶向聚集于巨核/巨核祖细胞的周围,从而提高hGH在促进血小板生成时的生物利用度,另一方面,也使TMP得以通过基因工程方法进行制备。在本实验中,我们首先将编码rTMP-GH的基因序列克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,通过与麦芽糖结合蛋白MBP进行融合而实现rTMP-GH在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,经过柱层析纯化、Xa因子酶切和再次纯化,最终获得重组融合蛋白rTMP-GH,经多方面的体外生物学活性验证后,进一步观察了该融合蛋白对急性重度骨髓型放射病小鼠血小板减少的促恢复作用。所取得的主要研究结果与结论如下:1.通过PCR扩增、酶切、连接与转化将编码rTMP-GH的基因序列克隆至pMAL-p2x质粒载体中,成功构建了重组表达质粒pMAL-rTMP-GH。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL-21,经0.1mol/L的IPTG于25℃诱导过夜,获得高效、可溶性表达的MBP-rTMP-GH融合蛋白（MBP-rTMP-GH占菌体总蛋白的55%以上）,采用疏水和阴离子柱层析获得纯化的融合蛋白MBP-rTMP-GH,经Xa因子酶切去除MBP,再通过分子筛层析获得纯化的rTMP-GH（蛋白纯度达95%以上）。2.SDS-PAGE电泳结果显示纯化所得的目的蛋白大小为24KD,与rTMP-GH的理论值一致;Western blot结果表明该目的蛋白可以与人GH抗体发生特异性反应,进一步证实纯化所得蛋白为rTMP-GH。3.体外细胞粘附实验结果表明,rTMP-GH融合蛋白与巨核细胞有很强的结合能力,提示融合蛋白中的TMP可以发挥特异性结合巨核细胞的作用;巨核细胞集落分析和MTT检测发现,rTMP-GH融合蛋白能显著促进巨核细胞的增殖,其效果明显优于单纯hGH和TMP处理组。4.Western blot和RT-PCR实验结果表明,rTMP-GH能够显著上调体外培养巨核细胞中血小板生成转录调控因子GATA-1的表达,进一步提示rTMP-GH具有促进巨核细胞增殖与分化和生成血小板的作用。5.体内动物实验结果表明:5Gyγ射线全身一次性照射可引起Balb/c小鼠外周血血小板显著减少,并于第16天左右时达最低值（<50,000/μl）。皮下注射400μg/kg的rTMP-GH融合蛋白,隔日一次,可显著提高受照小鼠外周血血小板数目,其效果明显优于rhGH治疗组和rhIL-11治疗组。骨髓切片结果显示,在照后第16天时空白对照组小鼠骨髓组织出血明显,有核细胞数显著减少,巨核细胞尤为少见,骨髓出现空虚现象;而rTMP-GH处理组骨髓造血组织丰富,造血重建明显,骨髓组织中有核细胞数量减少不明显,仅有少部分空虚现象,并可见到不同时期的巨核细胞。提示体内应用rTMP-GH融合蛋白具有显著促进血小板生成的作用。总之,本研究通过基因工程方法成功实现了rTMP-GH重组融合蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达与纯化制备,体内、外实验结果均表明该融合蛋白具有显著促巨核细胞增殖和血小板生成的作用,提示其在治疗血小板减少症方面具有很好的应用前景,值得进一步研究与开发。
论文目录
相关论文文献
- [1].重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究[J]. 第三军医大学学报 2008(21)
- [2].重组融合蛋白rTMP-GH对体外培养巨核细胞增殖的影响[J]. 第三军医大学学报 2008(01)