采用RNAi技术抑制‘澳洲青苹’苹果多酚氧化酶的研究

论文摘要

本研究以APPO为目的基因，通过农杆菌介导方法转化入‘澳洲青苹’苹果，采用RNAi技术，以期获得抗褐化的优良转基因苹果。通过研究影响农杆菌介导的‘澳洲青苹’苹果的遗传转化的因素，优化了‘澳洲青苹’苹果的遗传转化体系，建立了高效遗传转化体系，初步获得了携带DSAPPD为目的基因的苹果抗性苗。实验内容和研究结果如下：1．‘澳洲青苹’苹果无菌营养繁殖系的建立：研究了不同的消毒处理对外植体的影响及Vc、Ac、PVP、枝条遮光处理、低温暗处理对‘澳洲青苹’苹果初代培养中褐化的抑制效果。试验结果表明，70％酒精表面消毒30秒后用0.1％升汞浸泡消毒5分钟，再用无菌水冲洗5次，80％都没有污染。而对抑制褐变最佳的方案是幼芽用0.2％PVP浸泡后接种在含有Vc的培养基上低温暗培5-7天对褐变的抑制率可以达到最佳，‘澳洲青苹’苹果初代的成活率可以达到90％。2‘澳洲青苹’苹果再生体系的建立以‘澳洲青苹’苹果试管苗的叶片为外植体诱导不定芽再生，研究不同浓度的BA、TDZ、暗培养时间、叶片放置方式和AgNO3对叶片不定芽再生的影响。结果表明：最适宜的叶片不定芽再生的培养基为MS+TDZ2.0mg／L+NAA0.3mg／L+琼脂6g／L+蔗糖30g／L或MS+BA4.0mg／L+NAA0.2mg／L+琼脂6g／L+蔗糖30g／L，最适的暗培养时间是20d，不定芽的诱导率分别达到100％和91.7％。3．‘澳洲青苹’苹果遗传转化体系的建立以‘澳洲青苹’苹果的叶片为受体，确立了‘澳洲青苹’苹果的选择压，适宜的卡那霉素选择压10-25 mg／L．通过对影响遗传转化效率因子：共培养时间、培养基、抗生素种类、浓度、农杆菌浸染时间和卡那霉素选择压的优化，得出了较高转化效率的体系。浸染时间5 min，共培养时间3-4 d，卡那霉素选择压为12.5 mg／L。抗性愈伤率可以达到93.8％，抗性芽率可以达到14.1％。4．转基因苹果的检测通过GUS组织化学染色法，得到了4株GUS阳性植株，通过PCR检测间隔区YYT-1初步证明了目的基因已经整合到植物基因组。

论文目录

• 缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 果实褐化的研究进展
• 1.1 果实褐化的原因
• 1.1.1 褐变发生的条件
• 1.1.2 与褐变有关的酶及特点
• 1.1.3 PPO的底物
• 1.2 控制果实褐化的途径
• 1.2.1 非酶褐变
• 1.2.2 酶促褐变的控制
• 1.2.2.1 选用含酚类物质较少的水果
• 1.2.2.2 控制酶活性
• 1.2.2.3 控制氧气含量
• 1.2.2.4 利用漆酶
• 2 RNA干扰
• 2.1 RNAi的产生与发展
• 2.2 RNAi干涉的机制
• 2.3 RNAi作用途径
• 2.4 递送dsRNA的实验技术
• 2.4.1 粒子轰击法递送
• 2.4.2 稳定转化法递送
• 2.4.3 农杆菌渗入法递送
• 2.4.4 通过病毒诱导的基因沉默
• 2.5 RNAi在植物中的应用
• 2.5.1 RNAi在植物功能基因组研究中的应用
• 2.5.2 RNAi在植物改良中的应用
• 2.5.2.1 RNAi技术用于改良植物品质、改善植物营养价值
• 2.5.2.2 RNAi在植物花色改良方面的应用
• 2.5.2.3 RNAi在植物抗病的遗传改良方面的应用
• 2.5.3 RNAi在植物雄性不育方面的研究
• 3.‘澳洲青苹’苹果
• 3.1 ‘澳洲青苹’苹果品种来源
• 3.2 ‘澳洲青苹’苹果果实性状
• 第二章 ‘澳洲青苹’苹果离体叶片不定芽再生体系的建立
• 1.材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 无菌营养繁殖系的建立
• 1.2.1.1 表面消毒
• 1.2.1.2 防止褐化的方法
• 1.2.2 再生体系的建立
• 1.2.2.1 不同基本培养基对叶片再生的影响
• 1.2.2.2 BA对叶片再生的影响
• 1.2.2.3 TDZ对叶片再生的影响
• 3对叶片再生的影响'>1.2.2.4 AgNO₃对叶片再生的影响
• 1.2.2.5 叶片放置方式对叶片再生的影响
• 1.2.2.6 暗培养时间对叶片再生的影响
• 1.3 结果调查与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 无菌营养繁殖体系的建立
• 2.1.1 不同的消毒处理对外植体的影响
• 2.1.2 不同的处理对褐变的影响
• 2.1.2.1 维生素C防止褐变的作用
• 2.1.2.2 PVP防止褐变的作用
• 2.1.2.3 Ac防止褐变的作用
• 2.1.2.4 暗处理防止褐变的作用
• 2.1.2.5 低温暗处理
• 2.1.3 离体叶片再生体系的建立
• 2.1.3.1 不同的基本培养基对‘澳洲青苹’苹果离体叶片再生不定芽的影响
• 2.1.3.2 BA对‘澳洲青苹’苹果叶片不定芽再生的影响
• 2.1.3.3 TDZ对‘澳洲青苹’苹果叶片不定芽再生的影响
• +对‘澳洲青苹’苹果叶片不定芽再生的影响'>2.1.3.4 Ag⁺对‘澳洲青苹’苹果叶片不定芽再生的影响
• 2.1.3.5 叶片不同放置方式对‘澳洲青苹’苹果叶片不定芽再生的影响
• 2.1.3.6 暗培养对‘澳洲青苹’苹果离体叶片不定芽再生的影响
• 3 讨论
• 第三章 农杆菌介导的‘澳洲青苹’苹果遗传转化体系的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株及保存
• 1.1.3 农杆菌培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 卡那霉素选择压的确定
• 1.2.2 农杆菌浸染时间的确定
• 1.2.3 共培养时间对转化‘澳洲青苹’苹果叶片再生的影响
• 1.2.4 抑菌抗生素对转化‘澳洲青苹’苹果叶片再生的影响
• 1.2.5 As对转化率的影响
• 1.2.6 植物生长调节剂对‘澳洲青苹’苹果转化率的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素选择压对叶片转化再生的影响
• 2.2 浸染时间对‘澳洲青苹’苹果叶片转化再生的影响
• 2.3 共培养时间对‘澳洲青苹’苹果叶片转化再生的影响
• 2.4 抑菌抗生素对转化叶片再生的影响
• 2.5 As对‘澳洲青苹’苹果转化率的影响
• 2.6 在共培养时加植物生长调节剂对‘澳洲青苹’苹果遗传转化的作用
• 3.讨论
• 第四章 转基因苹果检测
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 引物设计
• 1.1.4 酶及生化试剂
• 1.1.5 仪器
• 1.1.6 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 ‘澳洲青苹’苹果抗性植株的GUS染色鉴定
• 1.2.2 ‘澳洲青苹’苹果抗性植株的PCR扩增检测
• 1.2.2.1 ‘澳洲青苹’苹果基因组的提取
• 1.2.2.2 PCR扩增目的基因
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因‘澳洲青苹’苹果植株的GUS组织化学染色检测
• 2.2 转基因‘澳洲青苹’苹果的PCR检测
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录:苹果双链RNAi（DSAPPO）序列
• 致谢