蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究

论文摘要

本文通过绘制抑菌曲线和牛津杯法,研究了蜂毒肽对金黄色葡萄球菌、酵母菌GS115、番茄叶霉孢子等多种病原菌和基因工程菌的抑杀作用及抑菌效力的影响因素。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、细胞流式仪、透射电子显微镜和扫描电子显微镜等实验技术,从蛋白质合成和表达、DNA复制和细胞超微结构的角度系统分析了蜂毒肽的抑杀菌机理。将蜂毒肽前体蛋白基因导入原核表达载体pET-42a（+）中,经PCR、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。结果表明:蜂毒肽对多种病原菌和基因工程菌都具有强烈、速效的抑杀作用,抑菌效果受pH值、温度等因素的影响。经流式细胞仪分析,蜂毒肽对菌体作用后,集中于Ⅰ（或G1）期的细菌数量增加,进入R（或S）期细菌数量减少,说明蜂毒肽的作用发生在I （或G1）期;而SDS-PAGE结果显示,药物作用后菌体蛋白谱带明显变浅,甚至消失,且这种作用是速效的;通过电子显微镜观察到经蜂毒肽作用后,菌体细胞穿孔、破裂或席卷式瓦解,细胞质外流,菌体裂解死亡。蜂毒肽能透过细胞壁,作用于细胞膜,在膜上形成孔洞,使膜破裂或席卷式瓦解,细胞内容物外泄死亡;进入细胞内,作用于蛋白质,抑制蛋白质的合成与表达或降解细胞内原有的蛋白,使细胞内蛋白质含量显著降低,细胞质固缩凝集;使DNA复制受阻而能不通过细胞周期的检查点,滞留在DNA复制期不能进入细胞分裂期,从而抑制细胞的分裂,这条途径可能是由于蜂毒肽对蛋白质的作用引起的。综上,蜂毒肽具有广谱、速效、高效的抑杀菌特性,可以克服当前生物农药存在的不足,对温度的不敏感和抑菌作用的稳定性都体现出蜂毒肽作为新型生物农药的开发潜力。为了解决蜂毒肽的来源这一瓶颈问题,我们将蜂毒肽前体蛋白基因和pET-42a（+）载体重组后,导入大肠杆菌BL21（DE3）中,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的诱导下,实现了蜂毒肽前体蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的融合表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 农药使用现状
• 1.2 生物农药的研究开发
• 1.2.1 生物农药的分类
• 1.2.2 生物农药的特点
• 1.2.3 生物农药在我国的发展现状及存在问题
• 1.2.4 生物农药的发展前景
• 1.3 抗菌肽综述
• 1.3.1 抗菌肽的分类
• 1.4 蜂毒肽综述
• 1.4.1 蜂毒肽的结构
• 1.4.2 蜂毒肽的功能
• 1.4.3 蜂毒肽的获得
• 1.4.4 蜂毒肽抑菌作用的分子生物学机理
• 1.4.4.1 膜裂解作用
• 1.4.4.2 作用于蛋白
• 1.4.4.3 离子的调节作用
• 1.4.5 蜂毒肽研究前景展望
• 1.5 本论文的意义
• 第二章 蜂毒肽对病原菌的抑制作用及其影响因素
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 供试菌株
• 2.1.3 微生物培养基
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的培养条件
• 2.2.2 菌种的活化培养
• 2.2.3 蜂毒肽的浓缩
• 2.2.4 生长曲线的绘制
• 2.2.5 牛津杯法测定蜂毒肽的抑菌作用
• 2.2.6 pH 值对蜂毒肽抑菌作用影响的测定
• 2.2.7 温度对蜂毒肽抑菌作用影响的测定
• 2.2.8 蜂毒肽抑菌作用影响的稳定性测定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 蜂毒肽对不同菌株的生长曲线的影响
• 2.3.2 不同pH 值下蜂毒肽的抑菌作用
• 2.3.3 不同温度下蜂毒肽的抑菌作用
• 2.3.4 蜂毒肽抑菌作用的稳定性结果
• 2.4 讨论
• 第三章 蜂毒肽抑菌机理研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 供试菌株
• 3.1.3 微生物培养基
• 3.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌株的培养条件
• 3.3.2 菌种的活化培养
• 3.3.3 SDS-PAGE 分析
• 3.3.4 透射电镜观察
• 3.3.5 扫描电镜观察
• 3.3.6 流式细胞仪分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 蜂毒肽对病原菌蛋白表达的影响
• 3.4.2 蜂毒肽作用病原菌的电镜观察
• 3.4.3 蜂毒肽对细胞分裂周期的影响
• 3.5 讨论
• 第四章 蜂毒肽基因的克隆与表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种及质粒
• 4.1.2 引物
• 4.1.3 酶、试剂盒及 DNA、蛋白标准物
• 4.1.4 实验试剂
• 4.1.5 微生物培养基
• 4.2 主要实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 基本试验方法
• 4.3.2 实验步骤
• 4.4 试验结果
• 4.5 讨论
• 结论
• 1. 蜂毒肽抑菌作用影响因素的研究
• 2. 蜂毒肽抑菌机制的研究
• 3. 蜂毒肽基因的表达
• 参考文献
• 致谢