本文主要研究内容
作者李美（2019）在《重组EGF在毕赤酵母中的组成型表达研究》一文中研究指出：表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是由53个氨基酸组成的多肽,分子量为6054 Da。EGF作用广泛,其不仅能够促使表皮细胞增殖和分化,在角质细胞的生长和迁移方面也有促进作用,从而促进成纤维细胞和胚胎细胞的增殖。因此,EGF在伤口愈合、加速损伤修复以及器官形成中发挥了巨大的作用。它还广泛用于各种化妆品中,因为它可以促进透明质酸,糖蛋白等的合成和分泌,并活化皮肤的基底细胞。随着对EGF研究的不断深入,其特殊的生物学效应被不断挖掘,成为近几年来研究的热点。毕赤酵母表达系统是近年来使用最广泛的表达系统。该系统中表达载体都是整合载体,其中pGAP系列与其他整合载体相比优势更为突出。首先,使用pGAP系统发酵时不需要添加甲醇,一方面可以节省甲醇的运输成本,另一方面也可以避免甲醇因易燃易爆带来的潜在危险。其次,发酵过程中不需要更换碳源,可以减少杂菌的污染,此外,pGAP表达系统采用连续发酵的方式,发酵工艺简单而且周期短,大大提高了生产效率,更有利于工业化生产。本研究的目的是利用三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母表达系统组成型表达EGF,并对发酵工艺进行优化。本研究首先以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础,根据酵母细胞密码子偏好性优化EGF基因序列并合成,在序列两端引入Xhol I和Eco R I位点,为方便纯化在目的基因前引入6×HIS,为实现蛋白的高效表达,选取融合标签-Asn-Gly,构建重组质粒pGAPZαA-6His-Asn-Gly-EGF。测序正确后,线性化电转至毕赤酵母感受态GS115。通过Zeocin抗性培养基和PCR鉴定筛选出成功整合到酵母基因组的工程菌,采用摇瓶培养,经Tricine-SDS-PAGE分析,获得了高表达重组蛋白的工程菌。本研究还对发酵工艺进行了探索,采用单因素实验方法优化发酵条件:最佳碳源,最佳pH值,最佳碳源浓度,最佳发酵温度,发酵时间和接种浓度。并采用Ni-Sepharose 6FF亲和层析柱纯化重组蛋白,用Bradford法检测EGF的分泌浓度。最后测定了经羟胺切割后的重组蛋白对Balb/c 3T3细胞的增殖活性。通过实验发现:高表达菌株在72 h具有最高的蛋白质表达,为0.05mg/mL。发酵条件经过优化得出:最佳碳源为甘油、其浓度为2.5%、发酵时间为72 h、接种量为2.0%、pH为6.0、温度为30℃。发酵液上清通过Ni-Sepharose 6FF柱成功获得了纯化的重组蛋白。生物活性实验结果表明,重组蛋白经羟胺切割后能够以剂量依赖的方式有效促进Balb/c 3T3细胞的增殖,具有良好的生物活性。
Abstract
biao pi sheng chang yin zi (Epidermal Growth Factor,EGF)shi you 53ge an ji suan zu cheng de duo tai ,fen zi liang wei 6054 Da。EGFzuo yong an fan ,ji bu jin neng gou cu shi biao pi xi bao zeng shi he fen hua ,zai jiao zhi xi bao de sheng chang he qian yi fang mian ye you cu jin zuo yong ,cong er cu jin cheng qian wei xi bao he pei tai xi bao de zeng shi 。yin ci ,EGFzai shang kou yu ge 、jia su sun shang xiu fu yi ji qi guan xing cheng zhong fa hui le ju da de zuo yong 。ta hai an fan yong yu ge chong hua zhuang pin zhong ,yin wei ta ke yi cu jin tou ming zhi suan ,tang dan bai deng de ge cheng he fen bi ,bing huo hua pi fu de ji de xi bao 。sui zhao dui EGFyan jiu de bu duan shen ru ,ji te shu de sheng wu xue xiao ying bei bu duan wa jue ,cheng wei jin ji nian lai yan jiu de re dian 。bi chi jiao mu biao da ji tong shi jin nian lai shi yong zui an fan de biao da ji tong 。gai ji tong zhong biao da zai ti dou shi zheng ge zai ti ,ji zhong pGAPji lie yu ji ta zheng ge zai ti xiang bi you shi geng wei tu chu 。shou xian ,shi yong pGAPji tong fa jiao shi bu xu yao tian jia jia chun ,yi fang mian ke yi jie sheng jia chun de yun shu cheng ben ,ling yi fang mian ye ke yi bi mian jia chun yin yi ran yi bao dai lai de qian zai wei xian 。ji ci ,fa jiao guo cheng zhong bu xu yao geng huan tan yuan ,ke yi jian shao za jun de wu ran ,ci wai ,pGAPbiao da ji tong cai yong lian xu fa jiao de fang shi ,fa jiao gong yi jian chan er ju zhou ji duan ,da da di gao le sheng chan xiao lv ,geng you li yu gong ye hua sheng chan 。ben yan jiu de mu de shi li yong san lin suan gan you quan tuo qing mei qi dong zi (pGAP)de bi chi jiao mu biao da ji tong zu cheng xing biao da EGF,bing dui fa jiao gong yi jin hang you hua 。ben yan jiu shou xian yi bi chi jiao mu biao da zai ti pGAPZαAwei ji chu ,gen ju jiao mu xi bao mi ma zi pian hao xing you hua EGFji yin xu lie bing ge cheng ,zai xu lie liang duan yin ru Xhol Ihe Eco R Iwei dian ,wei fang bian chun hua zai mu de ji yin qian yin ru 6×HIS,wei shi xian dan bai de gao xiao biao da ,shua qu rong ge biao qian -Asn-Gly,gou jian chong zu zhi li pGAPZαA-6His-Asn-Gly-EGF。ce xu zheng que hou ,xian xing hua dian zhuai zhi bi chi jiao mu gan shou tai GS115。tong guo Zeocinkang xing pei yang ji he PCRjian ding shai shua chu cheng gong zheng ge dao jiao mu ji yin zu de gong cheng jun ,cai yong yao ping pei yang ,jing Tricine-SDS-PAGEfen xi ,huo de le gao biao da chong zu dan bai de gong cheng jun 。ben yan jiu hai dui fa jiao gong yi jin hang le tan suo ,cai yong chan yin su shi yan fang fa you hua fa jiao tiao jian :zui jia tan yuan ,zui jia pHzhi ,zui jia tan yuan nong du ,zui jia fa jiao wen du ,fa jiao shi jian he jie chong nong du 。bing cai yong Ni-Sepharose 6FFqin he ceng xi zhu chun hua chong zu dan bai ,yong Bradfordfa jian ce EGFde fen bi nong du 。zui hou ce ding le jing qiang an qie ge hou de chong zu dan bai dui Balb/c 3T3xi bao de zeng shi huo xing 。tong guo shi yan fa xian :gao biao da jun zhu zai 72 hju you zui gao de dan bai zhi biao da ,wei 0.05mg/mL。fa jiao tiao jian jing guo you hua de chu :zui jia tan yuan wei gan you 、ji nong du wei 2.5%、fa jiao shi jian wei 72 h、jie chong liang wei 2.0%、pHwei 6.0、wen du wei 30℃。fa jiao ye shang qing tong guo Ni-Sepharose 6FFzhu cheng gong huo de le chun hua de chong zu dan bai 。sheng wu huo xing shi yan jie guo biao ming ,chong zu dan bai jing qiang an qie ge hou neng gou yi ji liang yi lai de fang shi you xiao cu jin Balb/c 3T3xi bao de zeng shi ,ju you liang hao de sheng wu huo xing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自吉林大学的李美，发表于刊物吉林大学2019-06-25论文，是一篇关于毕赤酵母表达系统论文,表达论文,发酵论文,活性检测论文,吉林大学2019-06-25论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自吉林大学2019-06-25论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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