三种重要水生动物病毒实时荧光PCR检测方法的建立

论文摘要

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鲴病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×101～3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系（相关4系数=0.9983）,最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3 h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白（MCP）基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员（新加坡石斑鱼虹彩病毒除外）的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×103pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测。制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.9984。组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性。与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测。根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT—PCR反应条件进行优化,建立了用于检测的实时荧光RT—PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其它多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2 pg/μL的总RNA,与普通RT-PCR的灵敏度对比试验表明,该方法的敏感度很高。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4 h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT—PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 实时荧光PCR的原理
• 1.2 实时荧光PCR中几个重要参数
• 1.3 荧光化学
• 1.3.1 SYBR荧光染料
• 1.3.2 TAQMAN探针
• 1.3.3 分子信标
• 1.3.4 荧光标记引物
• 1.3.5 杂交探针
• 1.3.6 复合探针
• 1.4 实时荧光定量PCR的应用
• 1.4.1 核酸浓度的定量
• 1.4.2 基因表达研究
• 1.4.5 单核苷酸多态性（SNP）及突变分析
• 1.4.6 医学病原体的检测
• 1.4.7 药物疗效考核
• 1.4.8 肿瘤基因检测
• 1.5 实时荧光定量PCR的展望
• 1.6 荧光PCR技术在水产病原微生物检测的应用现状
• 1.6.1 水产动物病原微生物的检测
• 1.6.2 总结与展望
• 第二章 TAQMAN实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鲴病毒
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 毒株及细胞
• 2.1.2 设备与试剂
• 2.1.3 引物和探针的设计与合成
• 2.1.4 定量标准品的制备
• 2.1.5 病毒DNA的抽提
• 2.1.6 CCV荧光定量PCR的建立和条件优化
• 2.1.7 CCV荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性试验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 CCV荧光定量PCR反应优化条件
• 2.2.2 CCV荧光定量PCR的特异性
• 2.2.3 CCV荧光定量PCR的灵敏度
• 2.2.4 绝对定量标准曲线的建立
• 2.2.5 CCV荧光定量PCR的重复性和稳定性
• 2.3 讨论
• 第三章 虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 毒株及细胞
• 3.1.2 设备和试剂
• 3.1.3 引物和探针的设计与合成
• 3.1.4 病毒DNA的抽提
• 3.1.5 荧光定量PCR的建立和条件优化
• 3.1.6 荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性实验
• 3.1.7 标准曲线制作
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 荧光定量PCR反应条件的优化
• 3.2.2 荧光定量PCR的特异性
• 3.2.3 荧光定量PCR与普通PCR的灵敏度比较
• 3.2.4 荧光定量PCR重复性实验
• 3.2.5 标准曲线的建立
• 3.3 讨论
• 第四章 鱼类神经坏死病实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 病毒和细胞
• 4.1.2 引物、探针的设计与合成
• 4.1.3 仪器、试剂盒及其它试剂
• 4.1.4 病毒滴度的测定
• 4.1.5 病毒核酸的提取
• 4.1.6 常规RT-PCR
• 4.1.7 荧光RT-PCR检测方法的建立和条件优化
• 4.1.8 荧光RT-PCR的特异性试验
• 4.1.9 荧光RT-PCR与普通RT-PCR灵敏度比较
• 4.1.10 荧光RT-PCR的重复性试验
• 4.1.11 荧光RT-PCR的临床检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 荧光RT-PCR反应条件的优化
• 4.2.2 荧光RT-PCR方法的特异性
• 4.2.3 荧光RT-PCR与普通RT-PCR灵敏度比较
• 4.2.4 荧光RT-PCR稳定性和重复性实验
• 4.2.5 荧光RT-PCR方法的临床检测
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢