柠条锦鸡儿CBF/DREB1基因的克隆及其过表达对提高拟南芥抗旱、抗冻能力的影响

论文摘要

低温、干旱和盐害等非生物胁迫严重影响植物的生长、发育和作物产量。DREB转录因子,能够特异性地结合DRE元件上的核心序列A/GCCGAC,启动下游与抗逆相关的功能基因的表达来响应对低温、高盐、干旱等胁迫。基于DREB在信号途径中的重要地位,本论文以柠条锦鸡儿DREB1基因为研究对象,以拟南芥野生型、CkDREB1基因过表达转基因纯合体植物为材料,进行了初步分析,结果如下:（1）从柠条锦鸡儿中成功分离了三个版本的CkDREB1基因的全长DNA序列,开放阅读框全长均为615bp。CkDREB1蛋白AP2上游和下游有DREB1亚家族成员一般都有的PKK/RPAGRxKFxETRHP保守序列和DSAWR保守序列,序列的同源性比对分析结果表明CkDREB1蛋白属于DREB蛋白家族的A-1亚家族。（2）Northern分析表明CkDREB1基因受低温强烈诱导,对干旱和ABA也有一定的响应,但对高盐处理不响应。（3）RT-PCR和Northern检测表明CkDREB1基因过表达纯合体株系中CkDREB1均有不同程度的过表达。冷驯化后,CkDREB1基因过表达株系的抗冻能力比野生型提高;干旱胁迫下,CkDREB1基因过表达株系叶片的持水能力比野生型更强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物逆境应答中的转录因子
• 1.1.1 AP2/EREBP 转录因子家族
• 1.1.2 DREB 亚家族转录因子
• 1.2 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 试剂及耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物培养
• 2.2.2 柠条锦鸡儿CkDREB1 基因的克隆及序列分析
• 2.2.3 柠条锦鸡儿CkDREB1 基因在不同胁迫条件下的表达模式分析
• 2.2.4 Northern 杂交
• 2.2.5 CkDREB1 过表达载体的构建
• 2.2.6 植物表达载体的农杆菌转化
• 2.2.7 转基因植物的获得及纯合体的获得
• 2.2.8 转基因植物的分子鉴定
• 2.2.9 转基因植物的表型分析
• 3 结果与分析
• 3.1 CkDREB1 基因的分离和序列分析
• 3.1.1 PCR 扩增CkDREB1 基因
• 3.1.2 pGM-T-CkDREB1 重组质粒的构建
• 3.1.3 CkDREB1 基因序列分析
• 3.2 柠条锦鸡儿CkDREB1 基因在不同胁迫条件下的表达模式分析
• 3.3 植物表达载体pCHF3-CkDREB1 的构建
• 3.4 重组质粒转化农杆菌
• 3.5 转基因植株的筛选
• 3.6 转基因植株CkDREB1 转录水平的检测
• 3.6.1 拟南芥总RNA 的提取
• 3.6.2 转基因纯合体T3 代植株RT-PCR 检测
• 3.6.3 转基因纯合体植株目标基因 Northern blot 检测
• 3.7 过表达 CkDREB1 纯合体在非生物胁迫下的表型分析
• 3.7.1 低温胁迫后转基因纯合体的生长情况
• 3.7.2 干旱处理 CkDREB1 过表达纯合体的表型分析
• 4 讨论
• 4.1 柠条锦鸡儿 CkDREB1 基因及其同源基因之间的序列分析
• 4.2 柠条锦鸡儿 CkDREB1 基因的表达模式与其功能的关系
• 4.3 CkDREB1 基因与非生物胁迫之间的关系
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介