高糖高脂作用下肾小球系膜细胞蛋白质组学研究

论文摘要

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病和高脂血症的发病率逐年上升，严重威胁人们的健康，其肾损害正日益受到人们的重视。研究表明，肾脏血流动力学、蛋白质非酶糖化、多元醇通路激活、细胞增殖和凋亡等多种因素与DN的发生、发展有关。另外，脂质沉积尚能损伤肾小球系膜细胞移动和收缩功能从而促进糖尿病肾病的进展。尽管系膜细胞在介导糖尿病和高脂血症所致肾病中的作用研究进展颇多，但其具体的发病机理至今仍不十分清楚。系膜细胞的增生、系膜基质增多是其共同的病变基础，但具体牵涉到哪些信号通路、离子通道和哪些蛋白等并不十分清楚，特别是对这些变化因素之间的复杂的、网络式的关联知之甚少，有必要运用一种高通量、立体式的方法对这些变化因素进行研究。近来的基因组和蛋白质组研究技术就是从整体的角度来研究一种或多种因素对机体影响的较好的方法，因基因型和表现型的不一致性使人们的视线越来越集中到蛋白质组的研究。本实验采用蛋白质组学方法分别研究高血糖、氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）及两者共同对人肾小球系膜细胞的影响，得出了相应的双向电泳图谱，分别找出了差异蛋白质点，进一步对差异蛋白质进行质谱分析，确定了15种蛋白质的性质，为糖尿病肾病发病机制的研究提供新的思路。胞蛋白质组学研究方法：1．将人肾小球系膜细胞分别置于含正常糖浓度（NC组）、高糖（HG组）、Ox-LDL（OX组）、高糖+Ox-LDL（HO组）及甘露醇高渗对照（OC组）培基中进行体外培养48小时，分别收集细胞，将细胞裂解，收集细胞总蛋白，进行双向凝胶电泳实验，第一向采用固相pH等电凝胶电泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，之后进行考马斯亮蓝染色。2．应用PDQuest双向电泳图像分析软件对2DE图像进行数字化分析匹配与对比，并通过统计学处理评价双向凝胶电泳结果。3．在重复实验中进行实验方法的优化与改良。4．分组在肾小球系膜细胞2DE图谱中选取20个明显表达差异的蛋白质点进行胶内胰蛋白酶解，再进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析；5．将质谱分析得出的肽质量指纹图经过MASCOT数据库检索分析后，识别鉴定各个蛋白质；6．通过搜索PDB及SWISS-PROT蛋白质数据库，对鉴定出的蛋白质进行功能查询。结果：1、采用优化的双向凝胶电泳技术取得了重复性较好的2DE图谱结果；2、经2-DE分离蛋白质，共获分离胶15块，每组3块，通过PDQuest图象分析软件对每组三块胶图谱分析后显示：NC组平均蛋白点数896±51、匹配点数733±34、匹配率81.9％；HG组平均蛋白点数791±86、匹配点数651±74、匹配率83.5％；OX组平均蛋白点数698±69、匹配点数591±54、匹配率84.7％；HO组平均蛋白点数659±56、匹配点数531±42、匹配率80.6％；OC组平均蛋白点数787±63、匹配点数657±53、匹配率83.5％。同一组三块胶的位置重复性显示：NC组水平偏差1.08mm±0.21mm，垂直偏差1.78mm±0.64mm；HG组水平偏差1.04mm±0.13mm，垂直偏差2.05mm±0.64mm；OX组水平偏差1.25mm±0.25mm，垂直偏差1.89mm±0.51mm；HO组水平偏差1.32mm±0.21mm，垂直偏差2.21mm±0.76mm；OC组水平偏差1.12mm±0.17mm，垂直偏差2.12mm+0.37mm。HG组与NC组比较共有差异蛋白质点42个，其中有24个点仅在NC组表达，18个点在HG组表达上调；OX组与NC组比较共有差异蛋白质点33个，其中有22个点仅在NC组表达，OX组有10个点表达上调，1个点表达下调；OC组与NC组比较共有差异蛋白质点35个，其中27个点仅在NC组表达，OC组有8个点表达上调；HO组与NC组比较共有差异蛋白质点26个，其中8个点仅在NC组表达，HO组有13个点表达上调，5个点表达下调。选取明显表达差异的20个蛋白质点作质谱分析，对这些蛋白质点进行肽质指纹图分析，鉴定出15种蛋白质，这些蛋白质涉及细胞骨架、细胞连接、细胞代谢、信号传导和核酸代谢。结论：1、通过差异蛋白质组分析发现，高糖促进人肾小球系膜细胞的增生及基质堆积可能与高糖引起系膜细胞的骨架蛋白、细胞连接蛋白及核酸代谢蛋白的表达改变有关。Ox-LDL可引起肾小球系膜细胞波形蛋白及属于连环蛋白家族的PKP4表达上调，与核酸代谢相关的蛋白表达下调，这可能与高脂诱导系膜细胞凋亡有关；在高糖和高脂共同作用下，系膜细胞的骨架蛋白、MAPK信号传导通路蛋白及核酸代谢相关蛋白的表达均发生改变，这些变化可能通过影响人系膜细胞的蛋白合成、分化、凋亡及系膜基质降解从而加速了糖尿病肾病的进程。糖尿病患者合并高脂血症会加剧肾脏损害。2、在15个鉴定出的蛋白质中，多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶9在肾脏组织中的表达得到验证；另外，属于β连环蛋白的PKP4及半桥粒板蛋白以往只在上皮细胞中被发现，本实验首次在人肾小球系膜细胞中发现其表达；3、经典的作为高渗对照的甘露醇，可引起人肾小球系膜细胞蛋白表达明显异常。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 高糖高脂作用下人肾小球系膜细胞蛋白质分离
• 1.1 前言
• 1.2 技术路线
• 1.3 材料与方法
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 1.6 小结
• 第二部分 高糖高脂作用下人肾小球系膜细胞蛋白质谱分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 总结
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 综述三
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果