论文摘要
龙须草（Eulaliopsis binata）是多年生禾本科兼性无融合生殖植物,其无融合生殖程度较高,胚和胚乳不需要受精能够自发形成,是利用无融合生殖固定禾谷类作物杂种优势的潜在资源。开发有效的分子标记,寻找与其无减数胚囊形成、孤雌生殖、胚乳自发产生等性状连锁的分子标记,是进一步研究其无融合生殖遗传和分子机理的基础。本研究以来自中国5个省12个不同居群的龙须草为材料,从分子生物学、细胞学、遗传学角度研究其无融合生殖特点。采用三种不同方法开发龙须草SSR引物,并利用筛选的多态性SSR引物和RAPD引物同时对杂交F1代分析,寻找不同生殖方式的单株及与生殖方式连锁的分子标记。通过去雄、杂交等田间遗传学实验和流式细胞仪对种子中胚和胚乳细胞倍性的检测,确定龙须草中有性生殖和无融合生殖单株,为龙须草无融合生殖遗传机理的研究奠定基础。主要结果如下:1.建立了适合龙须草的SSR反应体系:2×buffer:2μl;2.0 mmol/L Mg2+;0.2mmol/L dNTPs;0.3μmol/L SSR引物;80 n8模板DNA和0.5 U Taq酶。2.通过锚定PCR开发复合SSR位点的方法,在设计的33对引物中筛选到有效扩增的引物13对。引物开发效率大约36%。13对引物中表现多态性的引物有6对。利用基因特异序列法得到多态性引物3个。在使用的18对近源物种引物中有83%的SSR引物在供试的12个居群龙须草中都有清晰的SSR条带出现,其中10对（56%）引物表现出多态性。3.使用所开发的多态性SSR引物和RAPD引物对广东星子与陕西山阳居群杂交后代（F1代）进行分子标记检测,结果在后代中发现了五种表现类型:①与两亲本相比有缺失带;②双亲的互补带型;③偏父本带型;④偏母本带型;⑤不同于亲本的变异带型。这些结果揭示了龙须草杂交后代生殖方式以无融合生殖为主,呈现出多样性的特点。4.以直接套袋和去雄套袋作为对照,消除由于人工操作对结实率的影响。直接套袋的结实率显著高于去雄套袋和去雄杂交的结实率。表明人工去雄影响子房发育,降低了结实率。同时也说明人工去雄具有一定的可信度。去雄套袋较低的结实率说明其中有专性无融合生殖发生。去雄杂交结实率显著高于去雄套袋结实率,说明假受精或者有性生殖的发生促进了种子的形成,而花粉在其中发挥了重要作用。5.利用流式细胞仪对广东星子和湖南衡阳居群内各单株自然结实种子进行检测,结果显示星子14、衡阳11单株种子中胚与胚乳细胞的DNA相对含量倍性比为2C:3C,其它单株为2C:3C:4C。表明星子14、衡阳11单株的种子可能来自有性生殖,而其他单株的生殖方式则为兼性无融合生殖。
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摘要Abstract1 前言1.1 课题的提出及研究的目的和意义1.2 文献综述1.2.1 龙须草研究现状1.2.2 植物无融合生殖研究概况1.2.2.1 植物无融合生殖的概念和类型1.2.2.2 植物无融合生殖遗传学研究及发生机制分析1.2.2.3 植物无融合生殖鉴别的传统方法1.2.2.3.1 形态鉴别1.2.2.3.2 细胞胚胎学观察1.2.2.4 分子生物学在无融合生殖研究中的应用1.2.2.4.1 同工酶分析1.2.2.4.2 DNA分子标记1.2.2.4.3 mRNA差异显示技术1.2.2.5 兼性无融合生殖植物的不同后代类型1.3 SSR引物开发的研究进展1.3.1 基因组文库的构建1.3.2 微卫星富集法1.3.3 数据库搜索1.3.4 基于ISSR-PCR的SSR分离1.3.5 引物的转移性扩增1.3.6 锚定PCR开发复合SSR引物2 材料与方法2.1 龙须草SSR反应体系的建立2.1.1 材料2.1.2 方法2.1.2.1 基因组DNA提取2.1.2.2 SSR-PCR扩增2.1.2.2.1 引物2.1.2.2.2 SSR反应体系的优化2.1.2.2.3 SSR-PCR退火温度的优化2.1.2.2.4 SSR-PCR扩增程序2.1.2.2.5 3%琼脂糖凝胶（EB染色）检测2.2 龙须草SSR引物的分离2.2.1 材料2.2.2 方法2.2.2.1 基因组DNA的提取2.2.2.2 锚定PCR开发复合SSR引物2.2.2.2.1 基因组DNA酶切2.2.2.2.2 接头的准备2.2.2.2.3 接头连接2.2.2.2.4 目的片段的PCR扩增2.2.2.2.5 扩增产物的克隆测序2.2.2.3 基因特异序列的SSR引物开发2.2.2.4 近缘物种SSR引物的应用2.2.2.5 引物扩增的琼脂糖电泳筛选2.2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测2.2.2.6.1 变性PAGE凝胶的制备2.2.2.6.2 电泳2.2.2.6.3 染色2.2.2.7 数据统计2.2.2.8 通过SSR分析星子、山阳杂交组合后代2.3 兼性无融合生殖龙须草遗传学研究2.3.1 材料2.3.2 方法2.3.2.1 龙须草田间去雄、杂交试验2.3.2.2 龙须草杂交后代生殖来源的检测2.3.2.2.1 杂交后代的种植2.3.2.2.2 引物的选择2.3.2.2.3 杂交后代与亲本基因组DNA提取2.3.2.2.4 PCR扩增与检测2.3.2.3 流式细胞仪检测种子胚和胚乳的倍性水平3 结果与分析3.1 龙须草SSR反应体系的建立3.1.1 DNA提取结果3.1.1.1 紫外分光光度计测定结果3.1.1.2 0.8%琼脂糖凝胶电泳（EB染色）检测结果3.1.2 SSR技术体系的优化结果3.1.2.1 Taq酶浓度3.1.2.2 dNTP浓度2+浓度'>3.1.2.3 Mg2+浓度3.1.2.4 引物浓度3.1.2.5 优化的SSR反应体系3.2 龙须草SSR引物的分离3.2.1 锚定PCR开发复合SSR引物3.2.1.1 基因组酶切3.2.1.2 连接产物的PCR扩增3.2.1.3 阳性克隆的鉴定及引物设计3.2.1.4 锚定PCR开发复合SSR引物筛选结果3.2.2 基因特异性SSR引物和近缘物种引物筛选3.2.3 三种途径开发的SSR引物筛选结果3.2.4 多态性引物对星子、山阳F1代的检测3.3 兼性无融合生殖龙须草遗传学研究3.3.1 龙须草田间去雄、杂交试验结果3.3.2 RAPD分析不同组合F1杂交后代3.3.2.1 衡阳×星子杂交后代的检测3.3.2.2 西峡杂交后代的检测3.3.2.3 星子、山阳杂交后代检测3.3.3 流式细胞仪检测单株种子的DNA含量4 讨论4.1 在DNA提取实验过程中应注意的问题4.2 SSR技术体系的建立4.3 锚定PCR开发复合SSR引物4.4 数据库搜索和近缘物种SSR在龙须草SSR引物开发中的作用4.5 多态性引物对龙须草杂交F1代的分析检测4.6 龙须草兼性无融合生殖的特性参考文献致谢
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