副溶血弧菌的致病性分析及内标PCR检测方法的评价

论文摘要

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是一种以鱼类、贝类等海产品为主要载体传播的重要致病菌。人类食用受该菌污染或者加工不当的海产品可导致消费者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐等典型胃肠炎反应。我国食源性疾病监控网络数据显示,近年来我国沿海地区副溶血弧菌引起的食物中毒已成为细菌性食物中毒之首。舟山、宁波是我国华东地区海产品的重要产地,浦东和金山是对海产品消费需求较大的地区。本研究针对20062009年间来自上海浦东和金山、浙江舟山和宁波的158株副溶血弧菌临床分离株进行了血清型及毒力基因检测分析,旨在了解该菌在以上四地的血清型分布及流行趋势,为该菌的预防、控制及致病性分析提供参考数据;在此基础上建立了副溶血弧菌含内标PCR的检测方法,并就海产品样品中该菌检测的前处理技术进行了一些探讨和实践,主要研究内容和结果如下:一、副溶血弧菌食物中毒临床分离株的血清分型上海浦东、上海金山,浙江舟山、宁波四地158株副溶血弧菌临床分离株血清分型结果表明:主要流行株为O3:K6型,占67.72% （107/158）,其次为O1:K6、O3:K68、O1:K25、O1:K56、O2:K3型等。菌株来源地分析结果表明:上海金山病人分离株的血清型最复杂,表现出明显的多样性;浙江舟山血清型较单一,O3:K6型占当地分离株总数的87.80% （36/41）。二、副溶血弧菌食物中毒临床分离株的主要毒力基因分析利用PCR方法对上述158株副溶血弧菌临床分离株的主要毒力因子-耐热溶血素基因（tdh）和耐热相关溶血素基因（trh）进行检测,结果发现:158株临床分离株中（tdh+/trh-）菌株有147株,（tdh+/trh+）菌株有5株,（tdh-/trh-）菌株有6株。tdh和trh的阳性率分别为96.84% （153/158）和3.80%（6/158）。三、副溶血弧菌含内标PCR检测方法的建立和评价1)检测靶点的筛选及扩增内标的构建:通过在线BLAST比对,筛选出一个检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高的靶片段（hypothetical protein）。再通过随机重排软件设计一段与副溶血弧菌目的基因无同源性的序列来制备扩增内标,并将扩增内标片段链接到pMD 19-T载体上。2)PCR体系优化:将设计的特异引物,扩增内标质粒等加入到PCR体系中,对引物、扩增内标质粒的添加量和扩增条件进行优化。3)特异性:用本研究建立的副溶血弧菌含内标PCR检测体系对2株副溶血弧菌标准菌株,158株副溶血弧菌临床分离株和59株非副溶血弧菌分别进行PCR检测,发现所有副溶血弧菌均可扩增到451 bp的目的条带,而非副溶血弧菌只能扩增的到688 bp的扩增内标条带。4)灵敏度:当扩增内标的添加量为5.75×105拷贝/PCR时,副溶血弧菌基因组DNA的检测灵敏度可达0.504 fg/μL,纯培养物的检测灵敏度可达8.5×102 CFU/mL。四、牡蛎样品前处理方法的探索及实际样品检测定期采集上海市市售牡蛎,在无菌条件下进行解剖,获取牡蛎组织匀浆液,探讨不同离心力对菌体收集的影响,结果发现:在离心力为300×g条件下离心1 min,可沉淀匀浆液中的大颗粒杂质,进而在上清液中回收得到较高含量的菌体细胞。为后续PCR检测提供了质量良好的模板DNA。牡蛎组织中,采用四种细菌DNA提取方法进行比较,确定了AllMag○R磁珠试剂盒法（胍盐法）,它操作方便,快速,回收DNA纯度较高,能满足实际样品快速检测的需求。当牡蛎组织匀浆液以1:10加入到含3%NaCl的TSB液体培养基中,37℃,160 r/min,培养4 h后吸取适当含量的增菌液进行DNA提取, PCR方法可检测到副溶血弧菌,其结果和国标法检测结果一致。表明PCR检测方法在保证准确性的前提下,可以较大程度地缩短食品样品中副溶血弧菌的检测时间。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语索引
• 第一章 绪论
• 1 副溶血弧菌的生物学特性
• 2 副溶血弧菌血清型及流行病学特征
• 3 副溶血弧菌的主要毒力因子
• 4 副溶血弧菌检测方法
• 4.1 标准方法
• 4.2 KP 溶血试验
• 4.3 免疫学方法
• 4.4 核酸杂交
• 4.5 PCR 方法
• 4.6 环介导等温扩增技术
• 4.7 基因芯片技术
• 5 副溶血弧菌在牡蛎不同组织中的分布及检测
• 6 本课题研究的目的与意义
• 第二章 副溶血弧菌食物中毒临床分离株的血清分型
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 仪器和设备
• 2 实验方法
• 2.1 菌株活化
• 2.2 K 血清型鉴定
• 2.3 O 血清群鉴定
• 3 结果
• 3.1 158 株副溶血弧菌食物中毒临床分离株血清型鉴定
• 3.2 158 株副溶血弧菌临床分离株K 血清型和O 血清群分布
• 3.3 副溶血弧菌分离株血清型来源地分析
• 4 讨论
• 第三章 副溶血弧菌食物中毒临床分离株的主要毒力基因分析
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 仪器和设备
• 2 实验方法
• 2.1 158 株副溶血弧菌临床分离株模板DNA 的提取及质量检测
• 2.2 副溶血弧菌临床分离株毒力基因tdh，trh 的PCR 检测
• 3 结果
• 3.1 158 株副溶血弧菌临床分离株毒力基因tdh 和trh 检测结果
• 3.2 tdh 在158 株临床分离株中的分布情况
• 3.3 trh 在158 株临床分离株中的分布情况
• 4 讨论
• 第四章 副溶血弧菌内标 PCR 检测方法的建立和评价
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 牡蛎样品
• 1.3 培养基
• 1.4 主要试剂
• 1.5 仪器和设备
• 2 实验方法
• 2.1 副溶血弧菌含内标PCR 检测体系的构建
• 2.1.1 副溶血弧菌特异检测靶点的筛选及引物设计
• 2.1.2 副溶血弧菌标准菌株 DNA 提取
• 2.1.3 扩增内标的构建
• 2.1.4 副溶血弧菌PCR 检测体系及扩增条件
• 2.2 副溶血弧菌含内标PCR 检测体系的评价
• 2.2.1 特异性
• 2.2.2 灵敏度
• 2.3 牡蛎样品中副溶血弧菌的检测
• 2.3.1 牡蛎样品前处理
• 2.3.2 PCR 体系检测牡蛎组织中的副溶血弧菌
• 3 结果
• 3.1 副溶血弧菌含内标PCR 检测体系的评价
• 3.1.1 特异性
• 3.1.2 灵敏度
• 3.1.3 内标添加量的选择
• 3.2 牡蛎组织中副溶血弧菌的检测
• 3.2.1 离心力对牡蛎组织中副溶血弧菌回收率的影响
• 3.2.2 四种DNA 提取方法在牡蛎实际样品检测中的比较
• 3.3 副溶血弧菌PCR 检测体系在牡蛎组织中的应用
• 4 讨论
• 第五章 总结和展望
• 1 总结
• 2 展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文