结核分支杆菌HSP65的基因表达及其免疫学特性研究

论文摘要

结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）热休克蛋白6（5Heat Shock Protein 65, HSP65）是热休克蛋白60家族成员之一,由groEL2基因编码,是一种高度保守的蛋白质。该蛋白具有很强的免疫原性,在结核杆菌感染过程中,HSP65是机体对抗其入侵的重要的免疫保护性抗原之一,提示HSP65可能成为结核病预防和治疗的一个关键因素。本研究采用分子生物学方法分别构建MTB HSP65的原核重组质粒和真核重组质粒,测定分析了HSP65蛋白和真核重组质粒在小鼠体内的免疫学特性和抵抗MTB感染的保护力。1.采用PCR方法从MTB H37Rv株DNA基因组中扩增HSP65基因,与pMD18-T载体连接,酶切鉴定阳性重组质粒pMD-hsp65,经测序证实与Genebank公布的MTB HSP65基因序列完全一致。利用酶切位点将HSP65基因从pMD-hsp65中亚克隆入pPRO EX HTa原核表达载体,酶切鉴定阳性重组质粒pPRO-hsp65,并用IPTG进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE的结果表明,在相对分子量为65 Ku的位置有目的蛋白表达。用抗MTB HSP65的mAb及TB患者血清进行Western-blot鉴定,结果证实在相应的位置有特异性的结合条带。采用Ni-NTA亲和色谱柱在变性条件下纯化得到了HSP65蛋白。2.利用酶切位点将HSP65基因从pMD18-hsp65中亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（-）,酶切鉴定阳性重组质粒pcDNA-hsp65。将重组质粒用阳离子聚合物法稳定转染P815（H-2d）细胞。分别经RT-PCR和间接免疫荧光法证实,该重组质粒可在稳定转染的P815细胞中转录和特异性地表达。经过G418压力筛选,得到8株能稳定表达HSP65蛋白的P815细胞系。3.用HSP65原核表达蛋白及真核重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测两种疫苗各项免疫学指标。结果表明,HSP65亚单位疫苗和基因疫苗均可在小鼠体内刺激产生较强的体液和细胞免疫应答,并各有特点;均可显著减少感染小鼠体内的脾荷菌数,表明其可抵抗MTB的感染,但这种保护作用均未超过BCG。上述结论为进一步研究HSP65疫苗的免疫学特性及与其他疫苗的优势组合,用于TB新型疫苗的开发提供了实验数据和物质基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 TB 及TB 疫苗的研究进展
• 1.1 MTB 持续性感染的机制
• 1.1.1 持续感染过程的形成
• 1.1.2 MTB 在巨噬细胞中的存活
• 1.2 机体抗TB 的免疫应答
• 1.2.1 参与对MTB 免疫应答的细胞
• 1.2.2 参与对MTB 免疫应答的细胞因子
• 1.3 TB 疫苗的研究
• 1.3.1 亚单位疫苗
• 1.3.2 基因疫苗
• 1.3.3 减毒和营养缺陷型活疫苗
• 1.4 MTB HSP65 的研究进展
• 试验研究
• 第二章 MTB HSP65 蛋白的原核表达及纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 HSP65 基因的扩增和克隆
• 2.2.2 HSP65 基因原核表达载体的构建、表达及纯化
• 2.2.3 HSP65 表达蛋白Western-blot 分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 HSP65 基因的扩增和克隆结果
• 2.3.2 HSP65 基因的诱导表达及纯化结果
• 2.3.3 表达产物的Western-blot 鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 MTB HSP65 真核表达载体的构建及表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒和细胞
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 含HSP65 基因真核表达载体的构建
• 3.2.2 pcDNA-hsp65 稳定转染P815 细胞系的建立
• 3.2.3 RT-PCR 检测转染细胞中特定m RNA 的表达
• 3.2.4 间接免疫荧光检测重组质粒在P815 细胞中的稳定表达
• 3.3 结果
• 3.3.1 HSP65 基因真核表达载体的构建
• 3.3.2 重组质粒对P815 细胞稳定转染结果
• 3.3.3 重组质粒稳定转染P815 细胞系mRNA 的表达
• 3.3.4 重组质粒稳定转染P815 细胞系的蛋白表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 真和表达载体的选择
• 3.4.2 CTL 靶细胞系的选择
• 3.4.3 基因转染试剂的选择
• 3.5 小结
• 第四章HSP65 蛋白及重组真核质粒免疫学特性的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 免疫
• 4.2.2 ELISA 检测免疫小鼠血清中特异性抗体
• 4.2.3 小鼠脾淋巴细胞的分离制备
• 4.2.4 特异性淋巴细胞增殖实验
• 4.2.5 IFN-γ的诱生及其测定
• 4.2.6 免疫小鼠CTL 活性检测
• 4.2.7 MTB H37Rv 毒株对免疫小鼠的攻击实验
• 4.3 结果
• 4.3.1 免疫小鼠特异性抗体的水平
• 4.3.2 免疫小鼠特异性细胞免疫水平
• 4.3.3 亚单位疫苗和基因疫苗对MTB 感染小鼠的预防保护效果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介