小麦谷氨酰胺合成酶基因克隆及其苗期表达调控

论文摘要

氮素利用效率取决于氮素的吸收、同化和转移再利用过程。小麦生长发育过程中谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase）与氮代谢的过程密不可分。GS2参与氮素同化,GS1与氮素的转移再利用密切相关。氮素形态影响GS同工酶的表达调控,影响其在氮素吸收、同化及转移再利用的作用。因此克隆小麦GS基因,研究氮素形态对GS表达的影响,必将为通过转基因技术或优化氮素运筹措施提高氮素利用具有重要意义。具体研究内容如下:根据不同植物GS同工酶基因保守区序列设计引物,通过RT-PCR获得了小麦GS1和GS2同源序列;在此基础上,利用RACE技术获得了小麦GS1和GS2的全长cDNA序列。序列分析显示小麦GS1 cDNA全长为1494bp,其中5′UTR长74bp,3′UTR长349bp,ORF长1071bp,可编码356个氨基酸。小麦GS2的cDNA全长为1631bp,其中5′UTR为104bp,3′UTR为243bp,ORF长1284bp,可编码427个氨基酸。利用砂基水培试验,研究了氮素形态对小麦苗期叶片和根系生长发育过程中GS同工酶在转录和翻译水平的变化动态,以及GS活性、可溶性蛋白含量的动态影响。在叶快速伸长期,叶GS1-mRNA和GS2-mRNA大量转录,Native-PAGE结合活性染色在叶片分离到3种GS同工酶:GS同工酶活性:GS2>GS1>GSx;western-blot结果显示叶片具有44kD的GS2亚基和39kD的GS1亚基,亚基含量GS2>GS1。在叶片定长期,GS1-mRNA和GS2-mRNA转录减少;GS2和GSx活性增强,GSx活性较强几乎与GS2相似;GS1活性降低明显,活性表现为GS2>GSx>GS1;叶片GS1亚基含量降低,GS2亚基含量增加;GS活性和可溶性蛋白含量增加。叶片衰老期过程中,GS1-mRNA大量转录,GS2-mRNA转录停止;GS1同工酶活性增强,GS2和GSx活性降低明显,活性表现为GS1>GSx>GS2;GS活性略有增加,可溶性蛋白含量下降。在叶片生长发育过程中,根系GS1-mRNA含量无明显改变;根系仅分离到GS1,其活性在叶片定长期很弱;根系仅有39kD的GS1亚基表达,亚基表达趋势变化与同工酶活性变化趋势一致;根系GS活性无明显变化,在叶片衰老时略有降低。在叶片定长期,根系可溶性蛋白含量较低。无论是酶活性还是亚基表达以及可溶性蛋白,叶片比根系都要高得多。氮素形态对叶片和根系GS亚基的表达影响明显。硝态氮能诱导叶片快速伸长期GS2-mRNA和GS2同工酶的表达,抑制衰老期GS2的表达同工酶;硝态氮促进叶片保持较高的GS活性,但叶片可溶性蛋白含量较低。铵态氮能够促进根系GS1-mRNA的转录,在叶片快速伸长期使根系GS1亚基表达。在叶片定长期尿素促使根系GS1亚基表达。氮素形态对根系GS活性、可溶性蛋白含量影响不明显。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 小麦对氮素的吸收利用
• 1.2 GS 同工酶分布及其功能
• 1.3 GS 同工酶与作物氮素利用
• 1.4 影响GS 同工酶表达的因素
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验设计、试剂与仪器
• 3.1.1 水培试验
• 3.1.2 样品的采集和处理
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 测定项目与方法
• 3.2.1 总RNA 的提取和鉴定
• 3.2.1.1 Trizol 法提取总RNA
• 3.2.1.2 RNA 定量定性鉴定
• 3.2.2 GS 基因的克隆
• 3.2.2.1 GS1 基因的克隆
• 3.2.2.2 GS2 基因的克隆
• 3.2.3 生物信息学分析
• 3.2.4 半定量试验
• 3.2.5 酶粗提取液制备
• 3.2.6 GS 活性测定
• 3.2.7 GS 同工酶活性测定
• 3.2.8 可溶蛋白含量测定
• 3.2.9 western-blot 测定GS 同工酶亚基表达
• 4 结果与分析
• 4.1 GS1 基因的克隆和序列分析
• 4.2 GS2 基因的克隆和序列分析
• 4.3 GS 基因序列的同源多序列比对和系统进化分析
• 4.4 氮素形态对苗期小麦GS 基因转录动态的影响
• 4.4.1 RNA 质量鉴定
• 4.4.2
• 4.4.2.1 氮素形态对叶片GS1 基因表达的动态影响
• 4.4.2.2 氮素形态对叶片GS2 基因表达的动态影响
• 4.4.3 氮素形态对根系GS1 基因表达的动态影响
• 4.5 氮素形态对苗期小麦GS 同工酶活性的影响
• 4.5.1 氮素形态对苗期小麦叶片GS 同工酶活性的影响
• 4.5.2 氮素形态对苗期小麦根系 GS 同工酶表达的影响
• 4.6 氮素形态对苗期GS 同工酶亚基组成的影响
• 4.6.1 氮素形态对苗期叶片GS 同工酶亚基组成的动态影响
• 4.6.2 氮素形态对苗期根系GS 同工酶亚基组成的动态影响
• 4.7 氮素形态对小麦苗期GS 活性动态的影响
• 4.7.1 氮素形态对小麦苗期叶片GS 活性动态影响
• 4.7.2 氮素形态对小麦苗期根系GS 活性动态影响
• 4.8 氮素形态对苗期可溶性蛋白的影响
• 4.8.1 氮素形态对叶片可溶性蛋白含量的动态影响
• 4.8.2 氮素形态对根系可溶性蛋白含量的动态影响
• 5 结语与讨论
• 5.1 小麦GS 基因分析
• 5.2 氮素形态对GS1 和GS2 表达的调控
• 5.3 叶片和根中GS 同工酶与可溶性蛋白的关系
• 5.4 小麦叶片和根部GS 亚基表达的差异分析
• 5.5 GS 同工酶的鉴定及进一步研究
• 参考文献
• 英文摘要