地衣芽孢杆菌聚γ-谷氨酸合成酶复合体基因的克隆表达及发酵调控

论文摘要

聚γ-谷氨酸（poly-y-glutamic acid, y-PGA）是由L-和（或）D-谷氨酸单体通过)γ-谷氨酰键连接形成的一种非核糖体多肽,具有生物可降解性和良好的吸水性,作为环境友好型生物高聚物具有广泛的应用前景。由于γ-PGA结构的多样性、合成的多样性、代谢调控的复杂性以及γ-PGA合成酶的不稳定性,到目前为止,对其生物合成机制还没有形成共识。地衣芽孢杆菌WBL-3（Bacillus licheniformis WBL-3）是一种谷氨酸依赖型γ-PGA产生菌。本文根据Blicheniformis14580设计引物,从BlicheniformisWBL-3中克隆得到γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA（登录号：GQ249184）,与B. licheniformis 14580 pgsBCA基因的同一性为97%,与Bacillus subtilis IFO3336 pgsBCA基因的同一性只有74%。将pgsBCA基因克隆至表达载体pTrc 99A,构建表达质粒pTrc-pgs,将其转化Escherichia coliJM109得到基因工程菌E.col JMi-pgS。对E.coli JM-pgs进行发酵生产y-PGA, E.coli JM-pgs能产生胞外γ-PGA,产量为8.624g／L。推测B.licheniformisWBL-3与Bacillus subtilisIF03336有相似的γ-PGA催化机制,即由聚γ-谷氨酸合成酶单个酶催化合成。聚γ-谷氨酸（γ-PGA）及其衍生物是一种新型土壤修复和改良材料,能吸附土壤中的重金属和放射性核物质等污染物,也可作为保水材料应用于干旱环境以及化妆品领域。NaCl、Mn（Ⅱ）、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸四因素对BlicheniformisWBL-3合成γ-PGA产量及分子量有重要影响。分别用L-谷氨酰胺和a-酮戊二酸代替L-谷氨酸,BlicheniformisWBL-3未产生γ-PGA,说明BlicheniformisWBL-3为严格的谷氨酸依赖型产生菌。以NaCl（0-7%）,Mn（Ⅱ）（0-400μM）,L-谷氨酰胺（0-2.0 mM）,α-酮戊二酸（0-20 mM）进行单因素试验,表明：γ-PGA产量均随四因素浓度的增大呈现先增大后减小的趋势,γ-PGA产量分别在NaCl,Mn（Ⅱ）、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸浓度为6%（w／v）,100μM,1.5 mM和10 mM时达到最大值35.79g/L,24.77g/L,30.07g/L和26.09g/L；γ-PGA分子量随NaCl浓度的增大而增大,随α-酮戊二酸浓度的增大而减小,随Mn（Ⅱ）、L-谷氨酰胺浓度的增大而呈现先增大后减小的趋势。正交试验证明了单因素试验的结论,四因素间没有交互作用的影响,最优组合为NaCl：6%,α-酮戊二酸：10 mM,Mn（Ⅱ）：100μM,L-谷氨酰胺：1.5 mM,产量达到55.62g/L

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 选题背景及课题意义
• 1.2 聚γ-谷氨酸的研究历史及现状
• 1.3 目前存在的问题
• 1.4 本论文的主要研究内容
• 第二章 聚γ-谷氨酸合成酶复合体基因pgsBCA的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 小结
• 第三章 聚γ-谷氨酸合成酶复合体基因pgsBCA在大肠杆菌中的异源表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 小结
• 第四章 NaCl、Mn（Ⅱ）、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸对Bacilluslicheniformis WBL-3合成γ-PGA的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.4 小结
• 参考文献
• 在校期间研究成果及发表的学术论文
• 致谢