脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）生产乳糖酶的研究

论文摘要

β-半乳糖苷酶（β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶,β-D-galactoside galatohydrolase,EC3.2.1.23）通常被称为乳糖酶（Lactase）。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷的转移作用。利用乳糖酶生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的有效途径之一,具有重要的实际价值和理论意义。对一株应用于生产中的脆壁克鲁维酵母LSF-0612及其生产的乳糖酶进行了相关的研究,包括种子培养基的优化、发酵培养基与发酵条件的优化、酶学性质的分析和乳糖水解试验。通过对种子培养相关的单因素试验和正交试验,确定了种子培养的最佳种子培养基组分为:葡萄糖4%、酵母浸粉4%、氯化锰0.5mmol/L,培养时间24h,在此条件下菌体湿重可达到1.79g/100ml。通过对液态发酵产酶相关的单因素及正交试验,确定出液态发酵培养基的最佳组分为:乳糖4%,酵母浸粉3%,氯化锰1mmol/L,。最佳发酵条件为:接种量10%,温度28C,初始pH7.0,摇床转数180r/min,培养时间36h。在此条件下的液态发酵产酶,可使细胞内酶活高达1100U/ml,或者换算为4140U/g干菌体。通过对脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的酶学性质的分析结果表明:该酶的最适反应温度为40℃,在40℃条件下放置2h酶活还能达到90%以上;酶液在4℃条件下保存一个月才出现较为明显的酶活下降趋势;该酶的最适反应pH是7.0,pH的稳定范围在6.5-7.5。该酶水解乳糖的实验结果表明,该酶可以使乳糖水解率最终达到60%,而增加酶的用量可以缩短水解的时间。使用2%的添加量,4h的乳糖水解率可达到60%,水解乳糖的最佳温度是40℃,最适pH值为7.0,接近牛乳的天然pH,因而适用于牛乳中乳糖的水解。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 乳糖与乳糖不耐症
• 1.1.1 牛乳及其营养功能
• 1.1.2 乳糖
• 1.1.3 乳糖不耐症
• 1.1.4 乳糖不耐症的防治措施
• 1.1.5 存在问题
• 1.2 乳糖酶
• 1.2.1 乳糖酶及其来源
• 1.2.2 微生物乳糖酶的优点
• 1.3 乳糖酶的研究现状与应用
• 1.3.1 降解乳糖和生成低聚半乳糖
• 1.3.2 乳糖酶在乳品工业中的应用
• 1.3.3 在基因工程技术中的应用
• 1.3.4 乳糖酶的固定化技术研究
• 1.4 本实验的立题背景及依据
• 1.5 本实验的总体研究思路与技术路线
• 2 脆壁克鲁维酵母LSF-0612种子培养基的优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要仪器及设备
• 2.1.3 主要的生化及化学试剂
• 2.1.4 主要培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌种的活化传代
• 2.2.2 碳源的选择
• 2.2.3 氮源的选择
• 2.2.4 无机盐的选择
• 2.2.5 种子培养基成分正交试验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 碳源对菌体生长的影响
• 2.3.2 碳源浓度对菌体生长的影响
• 2.3.3 氮源对菌体生长的影响
• 2.3.4 氮源浓度对菌体生长的影响
• 2.3.5 无机盐对菌体生长的影响
• 2.3.6 无机盐浓度对菌体生长的影响
• 2.3.7 种子培养基成分的正交试验结果
• 2.4 本章小结
• 3 脆壁克鲁维酵母LSF-0612生产乳糖酶发酵条件的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要仪器及设备
• 3.1.3 主要的生化及化学试剂
• 3.1.4 主要培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 培养方法
• 3.2.2 胞内乳糖酶释放提取手段的选择
• 3.2.3 酶活性测定
• 3.2.4 酵母细胞增殖测定
• 3.2.5 发酵培养基的优化
• 3.2.6 发酵条件的优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 胞内乳糖酶释放提取手段的比较
• 3.3.2 发酵培养基的优化
• 3.3.3 发酵培养条件的优化
• 3.4 本章小结
• 4 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶酶学性质的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要仪器及设备
• 4.1.2 主要的生化及化学试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的粗纯化
• 4.2.2 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶最适作用温度
• 4.2.3 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的热稳定性
• 4.2.4 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的最适pH值
• 4.2.5 pH 值对脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶活性的影响
• 4.2.6 金属离子对脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶活性的影响
• 4.2.7 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶贮存稳定性
• 4.2.8 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶水解乳糖试验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶最适作用温度
• 4.3.2 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的热稳定性
• 4.3.3 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的最适pH值
• 4.3.4 pH值对脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶稳定性的影响
• 4.3.5 金属离子对脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶活性的影响
• 4.3.6 脆壁克鲁维酵母LSF-0612乳糖酶的贮存稳定性
• 4.3.7 LSF-0612乳糖酶水解乳糖试验结果
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢