基于血浆游离DNA浓度和完整性的肺癌非侵入性诊断价值研究

论文摘要

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,2000年男性肺癌死亡率40.1/10万,女性为17.2/10万,全球每年有超过100万名的新发肺癌患者。在我国每年因癌症死亡的病人中有近四分之一死于肺癌。而且随着环境污染日益加重,其发病率和死亡率有增长趋势。因此,肺癌的防治在恶性肿瘤的防治中极为重要。实践证明,肿瘤病人如能早期发现、早期诊断和早期治疗,对包括肺癌在内的大多数恶性肿瘤是非常有效的。目前临床上肺癌的诊断方法主要有影像学检查、痰细胞学检查、支气管内镜检查以及组织活检。胸部X线检查发现结节的敏感性限度是直径1cm,此时肿瘤已较大,可能已经侵犯支气管上皮和血管上皮。低剂量CT检出肺内小结节的能力较X胸片要强的多,对周围型肺癌检出率也较高,然而它在小的中心结节方面则敏感性差,易出现漏诊。痰细胞学检查,特别是多次痰检,对诊断起源于大气管的中心性肿瘤是有帮助的,如鳞癌和小细胞癌。但是对于起源于小气管的外周性肿瘤,如腺癌,特别是直径＜2cm者,其意义不大。另外,痰检筛查早期肺癌的敏感性也较低。支气管内镜检查在诊断侵袭前和早期侵袭性病变方面,可明显提高癌前病变和原位癌的检出率。然而,其检查范围也只局限与肺段口附近的支气管黏膜而无法检出周围性肺癌。组织活检有较高的灵敏度和特异度,但是它是一种极具创伤性的诊断方法,很难应用与肺癌病人的早期筛查。事实上,绝大部分肺癌病人被发现已是肿瘤晚期,临床实践证明,如果肺癌病人能够在早期被诊断出,80%病人可以有一个较长的生存期。因此,肺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低肺癌病死率,提高肺癌长期生存率的重要途径。1947年Mendel等首先发现血清/血浆中存在游离DNA,随后许多研究人员证实了在恶性肿瘤患者血清/血浆中游离DNA含量有较正常人群增高的现象。循环游离DNA（CFDNA）含量增加可能与肿瘤细胞坏死和凋亡有关。肿瘤坏死过程会释放出大量的DNA进入外周血,致使肿瘤病人血浆游离DNA含量升高。另外,肿瘤坏死过程所释放的DNA片段一般较长,也就是DNA完整性（DIA）较好,而正常人群循环游离DNA以凋亡为主,其DNA完整性较差。因此,肺癌病人的循环游离DNA含量及完整性均高于正常人群。肺癌病人循环游离DNA的这两个特性存在潜在的诊断价值。相对于传统的肺癌诊断方法的局限性（灵敏度和/或特异性低、创伤大）,循环游离DNA是一种无创或微创的肺癌诊断方法,因此值得深入研究。我们的研究内容就是评价血浆游离DNA含量和完整性在肺癌诊断方面的价值。另外,有文献报道在一些SLE病人、类风湿性关节炎病人、糖尿病病人中外周循环游离DNA含量也有增加的现象,因此也对它们当中的DNA含量及完整性也进行了研究并分析它与肿瘤病人和正常人群血浆游离DNA含量以及完整性方面的关系。我们第一部分工作是选择血浆游离DNA定量的方法（荧光定量PCR）,建立基因组DNA定量的标准曲线并评价评价该标准曲线的可靠性。由于CFDNA片段较短、在抽提过程易丢失、易降解。因此选择高效的、适合血清/血浆DNA抽提的方法是CFDNA研究的关键因素之一,我们研究的第二部分工作是对常用的四种血浆游离DNA的提取试剂盒做了比较,结果以磁珠法提取试剂盒抽提效果最好。为了便于与别的实验室数据比较,我们对该提取方法的提取效果作了全面评价。我们的第三部分工作是采用磁珠法提取试剂盒提取肺癌组病人、其他疾病组病人（包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及糖尿病病人）和正常组人群的血浆游离DNA,测定其中CFDNA的含量和完整性。最后采用ROC曲线分析,选取截断值。从灵敏度、特异度、约登指数和曲线下面积几个方面评价它们在肺癌非侵入性诊断方面的价值。对于循环游离DNA的定量我们采用了国际上应用较多的荧光定量PCR的方法。我们首先提取了基因组DNA,经紫外分光光度计定量后梯度稀释成2000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、5ng/ml五个浓度作为标准品,以引物actin100和actin400、基因组标准品为模板进行荧光PCR反应。所得到的基因组标准曲线的决定系数分别R2=0.9990,R2=0.9997;检测范围为5～2000 ng/ml。如果每个PCR反应体系中加入血浆游离DNA模板5μl,其血浆游离DNA的最低检测线可以达到1ng/ml。我们5次重复测量浓度为100ng/ml的样品所得到的测量值与真实值之差最大为1.51%,平均只有0.7%;最大变异系数CV为5.61%,平均变异系数只有3.68%。说明建立的基因组DNA标准曲线的准确性和重复性均较好,能够满足绝对定量的需要。通过对市场上常用的微量DNA提取试盒比较,我们发现磁珠法提取试剂盒在提取血浆游离DNA方面的效果最好。通过向血浆中投入一定量的质粒DNA方法测得磁珠法提取试剂盒的平均提取效率为56.6%,95%的可信区间为（53.8%～59.3%）;平均相对丢失率为43.4%,95%的可信区间为（41.7%～47.1%）;平均相对抑制率为-1.67%,95%的可信区间为（-7.8%～4.4%）;提取管变异系数为5.8%。我们以巢式引物actin100和actin400中产物较短的actin100为引物,测得肺癌病人血浆游离DNA浓度中位数为31.36（17.86-80.22）ng/ml,其它疾病组血浆游离DNA浓度中位数为32.79（13.35-90.90）ng/ml,正常人群组血浆游离DNA浓度中位数为11.20（5.51-20.66）ng/ml。经统计学检验,肺癌病人血浆游离DNA浓度与其它疾病组血浆游离DNA浓度没有统计学差异,这两组血浆游离DNA浓度均高于正常人群组血浆游离DNA浓度。肺癌病人血浆游离DNA完整性指数为0.67（0.33-0.89）,其它疾病组血浆游离DNA完整性指数为0.58（0.28-0.87）,正常人群组血浆游离DNA完整性指数为0.25（0.20-0.30）。肺癌组血浆游离DNA完整性指数大于其它疾病组血浆游离DNA完整性指数,其它疾病组血浆游离DNA完整性指数又大于正常人群组血浆游离DNA完整性指数。以循环游离DNA浓度作为肺癌诊断指标,ROC曲线分析显示其最大约登指数为0.49,ROC曲线下面积为0.805,95%可信区间为（0.764-0.845）。以循环游离DNA完整性指数作为肺癌诊断指标时最大约登指数为0.608,ROC曲线下面积为0.812,95%可信区间为（0.767-0.857）。二者相比,以游离DNA完整性指数作为肺癌诊断指标效果较好。在联合了游离DNA浓度和完整性指数以后,其最大约登指数为0.651,ROC曲线下面积为0.873,95%可信区间为（0.836-0.909）。与单一以游离DNA浓度作为诊断诊断指标相比,最大约登指数提高了32.9%,与单一以游离DNA完整性指数作为诊断诊断指标相比,最大约登指数提高了7.1%。以肺癌病人血浆游离DNA浓度为疾病诊断组,以SLE和RA合并组作为对照组,ROC曲线下面积为0.531,95%可信区间为（0.479-0.583）。以DM组作为对照组,ROC曲线下面积为0.677,95%可信区间为（0.593-0.762）。因此,循环游离DNA浓度和/或完整性指数在肺癌与其他疾病组的疾病鉴别诊断方面价值不大,需依靠其他指标。根据研究结果,我们可以得出以下结论:肺癌病人血浆游离DNA含量及完整性指数均高于正常人群;血浆游离DNA含量及完整性指数对于肺癌有较高的诊断价值,两个指标联合其诊断价值更高;其他疾病组血浆游离DNA含量及完整性指数均高于正常人群,两个指标在肺癌病人与SLE、RA、DM的鉴别诊断方面价值不大。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目次
• 引言
• 主要的仪器设备和试剂
• 仪器设备
• 试剂
• 所用溶液配方
• 1 基因组DNA标准曲线的建立与评价
• 1.1 引言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 2 血浆游离DNA的抽提与抽提效率的评价
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 基于血浆游离DNA的肺癌诊断价值评价
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果