限饲对肉鸡腓肠肌肌纤维与卫星细胞形态与功能的影响及机理研究

论文摘要

本研究以肉鸡为模型,研究不同生长阶段限饲（1～14 d和50～63 d隔日限饲）对腓肠肌肌纤维肥大和类型转化的即时和长期影响,以探讨早期限饲可能的代谢程序化作甩;通过检测血清激素水平的变化,甲状腺轴和生长轴相关基因,肌肉蛋白代谢与肌纤维类型相关基因,以及凋亡相关基因在腓肠肌的表达,进一步分析限饲影响肌肉生长的可能机制;在此基础上通过分离卫星细胞并进行体外培养,深入探讨早期限饲对卫星细胞相对活力以及卫星细胞相关功能基因表达的影响,通过在培养体系中添加T3,观察早期限饲以及限饲后恢复采食状态下卫星细胞对T3应答反应的差异,指出早期限饲可程序化地影响肌纤维肥大,并且这种影响主要由甲状腺轴和生长轴相关基因介导,而主要作用靶细胞是卫星细胞。1限饲对肉鸡腓肠肌生长的影响本实验选取1 d三黄雏鸡,随机分为自由采食对照组（Con）、1～14 d隔日饲喂的早期限饲组（EFR）和50～63 d隔日饲喂的后期限饲组（LFR）,分别于14、63 d采集腓肠肌外侧头和血液样品,检测不同阶段限饲对内鸡整体和肌肉生长的影响。结果表明:1)早期限饲组体重及腓肠肌外侧头重持续低于对照组（除9 w体重P＜0.05、差异显著外,其余均为P＜0.01、差异极显著）,后期限饲组63 d腓肠肌重显著低于对照组（P＜0.05）,但体重与对照组没有差异。2)早期限饲组14d血清T3、T4水平均显著低于对照组（P＜0.01）,63d血清T3水平仍显著低于对照组（P＜0.01）;后期限饲组63 d T3、T4与对照组无差异。3)早期限饲主要降低了直径较粗的腓肠肌快肌纤维的横截面积,且具有长期作用。后期限饲对所有肌纤维平均横截面积没有影响。4)14 d早期限饲组慢肌及快红肌肌球蛋白重链mRN脓达水平显著高于对照组（分别为P＜0.01和P＜0.05）,快白肌肌球蛋白重链基因表达显著低于对照组（P＜0.05）;63 d早期限饲组慢肌肌球蛋白重链mRNA基因表达显著低于对照组（P＜0.05）,快红肌和快白肌肌球蛋白重链与对照组相比均无差异（P＞0.05）。5)ATPase染色法检测到早期限饲组14d慢肌纤维含量增加,63 d慢肌纤维含量降低,快肌纤维含量增加。6)两种方法检测后期限饲组肌纤维类型均无变化。结果表明:1)早期限饲和后期限饲对肉鸡腓肠肌生长影响截然不同,早期限饲的影响较为显著并且持久,表现“程序化”作用;2)早期限饲阻碍了肉仔鸡肌纤维类型的转化,抑制了肌纤维的肥大,延缓了肌肉的发育及增重,最终降低肉鸡体重。3)甲状腺激素可能参与早期限饲程序化作用的调节。2限饲影响肉鸡腓肠肌生长的分子机理研究为了进一步探索早期限饲对肌纤维生长程序化作用的可能机理,本实验于14、63d采集垂体、肝脏及腓肠肌外侧头样品（用于分子生物学鉴定）及腓肠肌组织样,检测不同阶段限饲对生长轴和甲状腺轴相关基因、涉及蛋白代谢和肌纤维类型转化的相关候选基因（Calpain3,PGC-1,Calcineurin,NFAT）表达的影响,并对14 d肌肉腓肠肌组织的细胞增殖和凋亡情况进行了对比。结果表明:1)与对照组相比,早期限饲组14d肝脏GHR mRNA表达下调（P＜0.05）,腓肠肌IGFR-ImRNA表达上调（P＜0.05）,IGF-ImRNA表达下调（P＜0.05）,63d肝脏TRα表达上调（P＜0.05）,腓肠肌GHR和IGFR-I mRNA表达上调（P＜0.05）;后期限饲组除63d肝脏GHR mRNA表达上调（P＜0.05）外,其余基本没有变化;腓肠肌TRα表达在各组间均无差异。2)早期限饲组PCNA蛋白阳性较强的肌纤维极显著低于对照组（P＜0.01）,腓肠肌中BaxmRNA表达及Bax mRNA/Bcl-2 mRNA均显著高于对照组（P＜0.05）,暗示早期限饲组凋亡增加。3)早期限饲、后期限饲不影响4种蛋白代谢和肌纤维类型转化相关基因的表达。结果表明:1)早期和后期限饲通过截然不同的机制影响内分泌系统,早期限饲对肉鸡的代谢程序化影响涉及到各级组织中内分泌轴相关基因表达的改变。2)早期限饲抑制了14日龄肉鸡腓肠肌卫星细胞的增殖且可能促进了整个肌肉组织中细胞的凋亡。2)限饲不影响腓肠肌中相关蛋白代谢和肌纤维类型转化候选基因的表达,提示肌纤维类型的变化可能是肌纤维肥大受阻的继发作用。3早期限饲及恢复采食对腓肠肌卫星细胞增殖能力及内分泌轴基因表达的影响鉴于卫星细胞增殖是肌纤维肥大的必要条件,本试验选取1 d三黄雏鸡,随机分为三组（对照组、14天隔日限饲组与12天隔日限饲2天恢复组）,于14 d提取腓肠肌外侧头卫星细胞,荧光半定量PCR法检测其生长轴、甲状腺轴及凋亡相关基因的表达,并通过体外培养添加不同浓度（3ng/mL、6ng/mL和生理浓度12ng/mL）的T3观测各组卫星细胞的增殖状况。结果表明:1)14天限饲组卫星细胞IGF-ImRNA表达显著低于12天限饲2天恢复组（P＜0.05）,极显著低于对照组（P＜0.01）,12天限饲2天恢复组表达低于对照组（P=0.06）;GHR mRNA表达对照组极显著高于14天限饲组（P＜0.01）、显著高于12天限饲2天恢复组（P＜0.05）,后两组间没有差异（P＞0.05）;IGFR-ImRNA表达在14天限饲组、12天限饲2天恢复组均显著高于对照组（P＜0.05）,但后两组间没有差异（P＞0.05）。2)卫星细胞TRαmRNA表达在14天限饲组最高,与对照组差异显著（P＜0.05）、与12天限饲2天恢复组差异极显著（P＜0.01）,对照组与12天限饲2天恢复组间差异不显著。3)Bax、Bcl-2 mRNA表达在3组间没有差异,但Bax mRNA/Bcl-2mRNA 14天限饲组最高、12天限饲2天恢复组最低,两组间差异显著（P＜0.05）,但二组与对照组间均没有差异。4)体外培养MTT法测定卫星细胞活力和形态学观察结果一致,3组卫星细胞活力对照组最强,12天限饲2天恢复组其次,14天限饲组增殖能力非常弱。5)各浓度的T3处理对于14天限饲组卫星细胞均无影响;对照组卫星细胞在12 ng/mL T3处理下细胞活力24、48h时极显著高于空白对照组（P＜0.01）,72 h时与对照组无差异;12天限饲2天恢复组卫星细胞在6 ng/mL T3处理组48、72 h时细胞活力均显著高于空白对照组（P＜0.01）。结果表明:1)早期限饲显著降低了卫星细胞的相对活力,限饲后恢复自由采食可抑制凋亡并部分恢复卫星细胞的活力。2)内分泌轴相关基因的表达与卫星细胞活力相吻合,提示参与卫星细胞功能的调节。3)T3处理3天后,低于正常生理水平的T3（6 ng/mL）对限饲恢复后的卫星细胞的活力有促进作用,而正常生理水平的T3（12 ng/mL）对于对照组（正常）的卫星细胞的活力已经没有促进作用,提示早期限饲改变卫星细胞对T3反应的时间和剂量依赖性,可能参与补偿性生长的调控。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文部分的符号说明
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 禽类肌纤维生长的一般规律及其调控
• 1 禽类肌纤维生长发育的一般规律
• 2 肌纤维生长的调控
• 3 早期营养对肌纤维生长的程序化影响
• 第二章 禽类肌纤维类型及其影响因素
• 1 肌纤维的分型及其意义
• 2 禽类肌纤维类型的发育规律
• 3 肌纤维类型的影响因素
• 4 调节肌纤维类型相关基因的研究进展
• 第三章 肌卫星细胞的研究概况
• 1 肌肉卫星细胞的生物学特性
• 2 卫星细胞的鉴定
• 3 卫星细胞的功能及其调控
• 第二篇 试验研究
• 第一部分 限饲对肉鸡腓肠肌生长的影响
• 第四章 限饲对肉鸡体重、腓肠肌重和血清激素水平的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第五章 限饲对腓肠肌肌纤维截面积和类型的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二部分 限饲影响肉鸡腓肠肌生长的分子机理研究
• 第六章 限饲对肉鸡生长轴和甲状腺轴相关基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第七章 限饲对肉鸡腓肠肌肌纤维肥大和类型转化相关基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第八章 早期限饲对肌肉组织细胞增殖与凋亡的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第三部分 早期限饲及恢复采食对腓肠肌卫星细胞活力及内分泌轴基因表达的影响
• 第九章 早期限饲及恢复采食对肉鸡腓肠肌卫星细胞的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第十章 三碘甲腺原氨酸对腓肠肌卫星细胞活力的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 总体讨论
• 1 营养与肌纤维生长及肌纤维类型转化
• 2 卫星细胞功能及其营养调控
• 结论
• 本文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文情况