论文摘要
乳腺癌是当今女性最常见恶性肿瘤之一,好发于40～60岁妇女,世界范围内其发病率呈逐渐上升趋势。在我国,乳腺癌发病率已位居发达大城市女性恶性肿瘤的首位。如今乳腺癌的治疗方式是以手术治疗为主,辅助进行化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、放疗等辅助治疗。在各个辅助治疗方法中,内分泌治疗为一种非常重要的治疗方法,甚至可以说是各种辅助治疗手段中最重要最为有效的治疗手段,有其他几种治疗方法无法比拟的优势。主要优点：1、内分泌的治疗针对性和选择性很强；2、毒性比较缓和；3、价格低廉；4、内分泌治疗措施是唯一既有预防乳腺癌发生的作用,又可以用于治疗各个期别的乳腺癌患者。众所周知,乳腺癌的发生与发展与体内性激素尤其是雌激素水平有密切的关系,降低女性体内雌激素水平很可能会影响乳腺癌的发展,甚至有利于控制乳腺癌。雌激素对乳腺正常上皮细胞和激素依赖型乳腺癌的刺激作用与雌激素受体有非常密切的关系,雌激素受体ER是一种位于靶细胞核内的受体蛋白,雌激素与受体结合后形成ER复合物（ERE）,随后ERE进入核内激活蛋白质的合成,并且生成酶类,因此而促进靶细胞的增殖、分化。迄今为止,研究发现人类乳腺ER有两个亚型：命名为ERa和ERβ, Elwood Jensen和他的同事们等[1]1958年发现第一种雌激素受体；现在被命名为ERa,自从那以后,探索其功能取得了巨大的成功,如今已经知道了许多关于它的生物功能。然而,Kuiper GG等1996年瑞典发现一种雌激素受体新的亚型,命名为ERβ；奇怪的是ERβ与ERα表现为相反的生物效应功能。而且它们经常分布表达于不同的细胞或器官；由位于不同染色体上的不同的基因编码而成；ERα、ERβ的编码基因分别位于人6号和14号染色体,但结构上却有很多的相似,他们在氨基酸序列上有高度的同源性,对天然和人工激素的结合亲和性相似,但组织分布、转录激活活性有所不同,这些不同可能导致两者对激素敏感性和抵抗性的差异。组织或细胞的ERα是雌激素发挥作用的必要条件,ERα的表达水平临床上已多年被用来作为评价雌激素发挥作用的重要指标,但体内雌激素与ERβ结合发挥的机制却不明确,在雌激素作用下,ERβ即可自身生成同源二聚体,也可与ERα生成异源二聚体。自从1996年发现ERβ以来,它在乳腺癌发病机制中所担任的角色及其临床重要性一直存在激烈的争论。ERβ在许多组织,包括中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、泌尿生殖道、胃肠道、肾及肺等组织中均有表达,在乳腺组织中亦有表达,但相比而言,乳腺组织中ERβ显得更为重要,但是雌激素通过ERβ来诱发乳腺恶变的作用机制尚未明了.到目前为止,研究发现目前所知至少存在五个ERβ亚型：ERβ1-5。其中三种人类乳腺癌的ERβ的变异体已经被发现。这三种ERβ的亚型在人乳腺癌内可以发现相应的功能蛋白质,为[8,9]ERβ1、ERβ2、ERβ5这3种亚型,ERβ由8个外显子转录形成,由530个氨基酸组成。ERβ2到ERβ5与ERβ1不同的就是第8个外显子不同,其中这些亚型中有一个叫ERβcx （ERβ2）有一个唯一的C-末端,由26个氨基酸的外显子代替了第8个外显子,它在体外可以与ERα结合形成无功能的二聚体,而且它的主要功能是抑制ERα。多数研究表明ERα阴性的乳腺癌中ERβ有较高的表达率,有研究报道ERβ的表达和ERα、PR、肿瘤低级别等好的临床预后因素相关,有抗肿瘤增殖的作用。也有大量报道ERβ与临床病理因素如肿瘤大小、绝经状态、肿瘤分级、淋巴结情况、PR、HER-2无显著的相关性。有研究示ERβ在乳腺癌中的表达低于正常乳腺上皮细胞,ERβ可能是乳腺癌的重要指标及治疗靶点。Hartman J等实验研究、流行病学、诊断研究都指向ERβ看作为乳腺癌的一个重要的预后因素,并且努力探索最新的针对ERβ靶向治疗的乳腺癌的新的治疗方法。虽然如此但对ERβ的研究的仍然很少。本研究从蛋白水平上分析ERβ在乳腺癌原发灶及腋窝转移淋巴结中的表达规律,并分析乳腺癌发展过程中ERβ的变化以及各期乳腺癌中原发灶中ERβ的表达情况,研究其对乳腺癌的预后评估价值和药理学新靶点的用途。目的探讨ERβ蛋白在乳腺癌原发灶和转移淋巴结中的表达情况及其与其他指标的相关性,以探讨乳腺癌转移过程中激素受体是否下调,是否变异。另探讨各期乳腺癌中ERβ的表达差异,以探讨ERβ的表达是否可作为乳腺癌的一项预后指标。方法收集2010年3月至2010年12月期间于南方医院住院并经手术治疗的乳腺癌病例,从中选择临床资料和病理诊断资料都完善的病例,项目包括：病案号、性别、姓名、年龄、种族、家庭地址、联系电话、肿瘤部位、象限、肿瘤大小、病理号、病理类型、组织分级、临床分期、淋巴结转移情况、免疫组化ERα、PR、HER-2结果等。同时剔除术前曾接受新辅助性治疗的病例,剔除乳腺癌复发病例,符合所有条件的病例共104例。将这104例临床资料完整的乳腺癌病例,分为两大组,腋窝淋巴结转移阴性组55例,腋窝淋巴结转移阳性组49例,采用免疫组化法检测各组标本中ERβ蛋白的表达情况。获得收集的104例乳腺癌组织及转移淋巴结组织保存于-80℃冰箱中,然后统一制作成相应的石蜡块,制作免疫组化用病理白片。乳腺癌原发灶组织白片尽量切取准确的肿瘤组织,腋窝淋巴结先进行常规病理HE染色检查,以确定是否为转移淋巴结组织,步骤为首先脱蜡需经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ（应完全透明）、无水酒精Ⅰ（变为不透明）、无水酒精Ⅱ、95%酒精、80%酒精、自来水洗等步骤；染色需通过蒸馏水、苏木素液染核、自来水洗、1%盐酸酒精分化、流水冲洗、碳酸锂饱和水溶液反蓝、流水冲洗、复染0.5%伊红水溶液（对比染色）。逐级升酒精浓度脱水、自来水洗（分化伊红）、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ、接下来透明需经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ最后盖下玻片封固。各组病理切片采用Envision试剂盒行快捷二步法免疫组化染色。石蜡切片（2um）脱蜡至水,柠檬酸缓冲液微波高档抗原修复25min,双蒸水冲洗3次,PBS冲洗3次,每次3min；过氧化氢酶阻断液微波低档孵育3min,清除内源性过氧化物酶活性,双蒸水冲洗3次,PBS冲洗3次,每次3min,滴加ERβ兔抗人单克隆抗体（北京中杉金桥生物制品技术有限公司）,电热恒温培养箱37℃孵育1小时,PBS冲洗3次；滴加酶标羊抗兔IgG聚合物二抗试剂（福州迈新生物技术开发有限公司）,培养箱中37℃孵育30min, PBS漂洗3次；室温下DAB试剂显色约5min,自来水冲洗后苏木素轻度复染约1min,盐酸酒精分化约6s,酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封固切片。染色可疑者即行重新标记染色。以PBS取代一抗作阴性对照,以已知阳性反应片作阳性对照。ERp免疫组化染色以细胞胞核呈清晰棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达,其表达强度参照半定量积分法标准进行评分。1)阳性细胞百分率：无细胞显色为0分；<25%的细胞显色为1分；25%-50%的细胞显色为2分；>50%的细胞显色为3分。2)染色情况：显色深浅不一或显色不清为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；深褐色为3分。综和评分：0-1分为阴性（-）；2-3分为弱阳性（+）；4-5分为中度阳性（++）；>5分为强阳性（+++）。采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,组内及组间的表达的差异性为两计数资料的之间差异的比较采用Pearson卡方检验。组内及组间表达的相关性分析采用Spearman相关分析,相关系数用r表示。以p<0.05为标准认为有统计学意义。结果1、ERβ在腋窝淋巴结转移阳性组的乳腺癌原发灶、腋窝转移淋巴结中的阳性表达率分别为69.39%（34/49）、63.27%（31/49）,其差异无统计学意义（x2=0.411,p=0.521）：2、腋窝淋巴结转移阴性组乳腺癌原发灶与腋窝淋巴结转移阳性组乳腺癌病灶之间的ERβ表达差异有统计学意义（x 2=4.970,p=0.026）；腋窝淋巴结转移阴性组乳腺癌原发灶ERβ的表达高。3、ERβ的表达与年龄无相关关系（r=0.027 p=0.788）,与肿物大小、腋窝淋巴结转移个数呈负相关关系,但相关的密切程度不大,相关系数及P值分别为（r=-0.358 p=0.000）、（r=-0.255 p=0.009）；4、腋窝淋巴结转移阴性组中ERβ与年龄的无显著的相关性关系（r=-0.084p=0.542）,与肿物的大小呈显著的负相关关系,但相关的密切程度不大（r=-0.363p=0.007）；腋窝淋巴结转移阳性组原发灶中ERβ与年龄无相关关系（r=0.141p=0.333）,与肿物大小、腋窝淋巴结转移个数呈负相关关系,但相关的密切程度不大,相关系数及P值分别为（r=-0.302 p=0.035）、（r=-0.325 p=0.023）；5、乳腺癌原发灶中ERp表达与ERa表达呈正相关关系,（r=0.435p=0.000）；ERβ的表达与PR呈显著的正相关关系（r=0.425 p=0.000）；6、ERp的表达与HER-2呈显著的负相关关系,但相关的密切程度不大（r=-0.250 p=0.010）：7、ERa阴性乳腺癌中ERβ与HER-2表达无显著的相关性关系,（r=-0.150 p=0.332）,ERα阳性乳腺癌中ERβ的表达与HER-2的表达呈负相关性关系,但相关的密切程度不大（r=-0.274 p=0.034）。结论1、乳腺癌原发灶和腋窝转移淋巴结中ERβ的表达无显著统计学差异,说明乳腺癌在转移过程中受体的表达水平并未下调,因此手术后的病人进行辅助内分泌治疗及ERβ的靶向治疗在乳腺癌原发灶和转移灶中可能能达到相似效果。2、通过分析各期乳腺癌的ERβ的表达情况,其表达与年龄无相关性,与肿块大小、腋窝淋巴结转移个数呈负相关关系,说明ERβ为乳腺癌预后良好的一个重要指标。3、ERβ与ERα、PR的表达呈显著的正相关关系,提示ERβ可能为乳腺癌预后良好的指标,也预示ERβ可能依赖于体内ERα、PR的存在而起到抗肿瘤的作用.也可能提示ERp在ERα、PR阳性的乳腺癌细胞中起到抗肿瘤的作用并且提示ERβ介导的雌激素的生物效应可能在乳腺癌的发生中起到一定的作用。4、ERβ与HER-2呈显著负相关关系,HER-2为肿瘤增殖指标之一,ERβ与其有显著的负相关关系,说明ERβ有抗肿瘤作用,并可能作为乳腺癌良好预后的一个指标。5、ERα阴性乳腺癌中ERβ的表达与HER-2的表达无显著的相关性关系,ERα阳性乳腺癌中ERβ的表达与HER-2的表达呈负相关性关系。说明ERα阴性乳腺癌与ERα阳性乳腺癌当中,ERβ介导的生物效应可能不相同,但尚不能明确说ERβ在ERα阳性乳腺癌中起抗肿瘤作用,ERα阴性乳腺癌中起促进肿瘤增殖作用。
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