论文题目: 昆虫病原细菌Photorhabdus胞内晶体蛋白生物学功能的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 游娟
导师: 梁世中,韩日畴
关键词: 胞内晶体蛋白,酿酒酵母
文献来源: 华南理工大学
发表年度: 2005
论文摘要: 昆虫病原Photorhabdus属细菌为昆虫病原异小杆属Heterorhabditis线虫的共生细菌，在这类线虫的产业化培养中发挥重要作用。初生型共生细菌产生两种型态的胞内晶体蛋白CipA及CipB。由于此类晶体蛋白不能为细菌自身所利用，且氨基酸组成与线虫的营养需求相似，它们的大量产生被认为与细菌的共生性有关。鉴于共生系统的复杂性及其它代谢物质的干扰，胞内晶体蛋白的生物学功能一直未能确定。共生细菌胞内晶体蛋白的研究，不仅有利于线虫—细菌共生机制的探索，而且将促进线虫的产业化。 为探索共生细菌产生的胞内晶体蛋白在共生系统中的生物学功能，本论文从P．luminescens H06菌株中扩增其编码基因cipA、cipB，并分别在原核(大肠杆菌)和真核(酿酒酵母)表达系统中表达，然后分别将重组菌株与三种昆虫病原线虫[Steinernema longicaudum X-7(X-7)、S．carpocapsae All(All)和Steinernema sp．Sy-5(Sy-5)]以及海洋饵料线虫Panagrellus redivivus共培养，生物测定所表达的目的蛋白对线虫生长发育的影响。 结果表明：H06菌株的cipA和cipB序列与业已报道的Hm菌株对应序列的同源性均为93％。 在构建pCR4-TOPO-cipA和pCR4-TOPO-cipB克隆载体的基础上，论文构建了两种原核高效表达载体pET-15b-cipA及pET-15b-cipB，以化学转化法对蛋白酶缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)进行转化并在抗性平板上筛选出阳性克隆。所构建的重组质粒在宿主菌中具有良好的稳定性，无选择压力下传代培养，目的蛋白表达量保持在菌体总蛋白的27％～35％。重组CipA及CipB蛋白的诱导表达量分别达到30.9％和32.6％，均于胞内形成包涵体蛋白，胞外未有目的蛋白的渗漏表达。以温和的、非机械破壁方法初步纯化重组CipA、CipB蛋白以及H06菌株产生的Cip蛋白混合物，三者的得率分别为：78.8％、88.9％、89.1％。通过五次免疫新西兰大耳兔分别获得CipA及CipB的多克隆抗血清，间接ELISA法监测免疫过程实验动物血清中抗体的产生情况；免疫印迹检测说明由大肠杆菌大量表达的重组蛋白即为P．luminescens H06菌株的两种胞内晶体蛋白CipA和CipB。 生物测定发现：液体培养状态下，胞内晶体蛋白作为线虫重要的营养来源，并与第二代感染期线虫的形成直接相关。以可大量表达重组胞内晶体蛋白的大肠杆菌分别与无菌一龄Steinernema longicaudum X-7、S．carpocapsae All以及Steinernema sp．Sy-5线虫建立固体及液体培养组合，结果表明，在液体培养系统中，除了All品系线虫在CipB蛋白中未能完成发育外，所有测定线虫都能够于存在至少一种Cip蛋白的组合中完成世代，获得感染期线虫，没有Cip蛋白存在的组合，未能获得感染期线虫；固体培养系统中，测定线虫可在所有组合中完成世
论文目录:
中文摘要
英文摘要
英文缩略词表
第一章 绪论
1.1 昆虫病原线虫及其共生细菌
1.1.1 线虫-细菌共生系统及其生活史
1.1.2 昆虫病原线虫的应用及其产业化
1.2 昆虫病原细菌的型态变异
1.2.1 昆虫病原细菌型态变异的生物学特征
1.2.2 昆虫病原细菌型态变异的机制
1.3 昆虫病原细菌胞内晶体蛋白的研究进展
1.3.1 胞内晶体蛋白的理化性质
1.3.2 胞内晶体蛋白生物学功能的探讨
1.3.3 目前研究晶体蛋白的技术
1.4 大肠杆菌原核表达系统
1.5 酿酒酵母真核表达系统
1.6 本课题的研究背景、意义和主要内容
1.6.1 研究背景和意义
1.6.2 研究内容
第二章 cip基因的克隆及大肠杆菌原核表达
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 质粒与菌株
2.2.3 实验动物
2.2.4 主要试剂
2.2.5 培养基与常用溶液
2.3 技术路线
2.4 实验方法
2.4.1 细菌的培养
2.4.2 细菌基因组DNA的提取
2.4.3 DNA浓度的测定
2.4.4 核酸的浓缩与纯化
2.4.5 重组克隆载体pCR4-TOPO-cipA及pCR4-TOPO-cipB的构建
2.4.6 大肠杆菌表达载体pET-15b-cipA及pET-15b-cipB的构建
2.4.7 重组大肠杆菌生长曲线的测定
2.4.8 重组大肠杆菌的诱导表达
2.4.9 重组质粒稳定性检测
2.4.10 蛋白的抽提和纯化
2.4.11 动物的免疫
2.4.12 抗血清的制备及ELISA测定
2.4.13 Western blot印迹分析
2.5 结果与讨论
2.5.1 cipA及cipB基因的获得
2.5.2 重组克隆载体的构建
2.5.3 重组表达载体的构建
2.5.4 重组蛋白的诱导表达
2.5.5 重组大肠杆菌的生长曲线
2.5.6 重组大肠杆菌中质粒稳定性的研究
2.5.7 蛋白的纯化
2.5.8 抗血清的获得及ELISA分析
2.5.9 免疫印迹分析
本章小结
第三章 重组大肠杆菌-昆虫病原线虫系统的生物测定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要仪器设备
3.2.2 菌株、线虫与宿主昆虫
3.2.3 主要试剂
3.2.4 培养基与常用溶液
3.3 技术路线
3.4 实验方法
3.4.1 细菌的培养
3.4.2 昆虫病原线虫的制备
3.4.3 细菌-线虫液体培养系统的建立
3.4.4 细菌-线虫固体培养系统的建立
3.4.5 共生细菌培养上清对胞内晶体蛋白生物学功能的影响
3.4.6 镜检与数据分析
3.5 结果与讨论
3.5.1 无菌J1线虫的获得
3.5.2 液体培养系统线虫的生长繁殖
3.5.3 固体培养系统线虫的生长繁殖
本章小结
第四章 cip基因的酿酒酵母真核表达
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 主要仪器设备
4.2.2 质粒与菌株
4.2.3 主要试剂
4.2.4 培养基与常用溶液
4.3 技术路线
4.4 实验方法
4.4.1 重组穿梭载体的构建
4.4.2 酵母的转化
4.4.3 重组酵母转化子的筛选
4.4.4 重组质粒的稳定性
4.4.5 重组酿酒酵母的半乳糖诱导表达
4.4.6 表达产物分析
4.5 结果与讨论
4.5.1 酵母表达载体pYES2.1/VS-His-TOPO
4.5.2 重组表达载体的构建
4.5.3 重组酿酒酵母的诱导表达
4.5.4 重组酿酒酵母的生长曲线
4.5.5 重组酿酒酵母质粒稳定性的研究
4.5.6 表达产物的免疫印迹分析
本章小结
第五章 基因工程菌-海洋线虫系统的生物测定
5.1 引言
5.2 实验材料与设备
5.2.1 主要仪器设备
5.2.2 菌株与线虫
5.2.3 主要试剂
5.2.4 培养基与常用溶液
5.3 技术路线
5.4 实验方法
5.4.1 菌株的培养
5.4.2 线虫的制备
5.4.3 重组大肠杆菌-海洋线虫培养系统的建立
5.4.4 重组酿酒酵母-海洋线虫培养系统的建立
5.4.5 镜检与数据分析
5.5 结果与讨论
5.5.1 无菌J1线虫的制备
5.5.2 重组大肠杆菌对海洋线虫的营养作用
5.5.3 重组酵母对海洋线虫的营养作用
本章小结
结论与展望
参考文献
攻读学位期间发表的论文
致谢
附录
发布时间: 2006-09-19
参考文献
- [1].苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry55Aa和Cry5Ba的毒性区确定与毒力改造[D]. 王奋山.华中农业大学2012
- [2].苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba沉默机制的研究及杀线虫毒力因子Bmp1的功能鉴定[D]. 罗晓霞.华中农业大学2012
相关论文
- [1].昆虫病原线虫新属崇明拟异小杆线虫及其共生菌新种嗜线虫沙雷氏菌的系统分类[D]. 张崇星.南京农业大学2009
- [2].Xenorhabdus bovienii A54菌株杀虫物质的研究[D]. 王立霞.中国农业科学院2000
- [3].嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫活性相关分子机制[D]. 刘峥.中国农业科学院2003
- [4].嗜线虫致病杆菌杀虫蛋白的分离纯化及杀虫蛋白基因克隆[D]. 王勤英.河北农业大学2004
- [5].昆虫病原线虫共生菌培养与活性研究[D]. 王永宏.西北农林科技大学2004
- [6].黑豆蚜（Aphis craccivora）胞内共生菌的研究[D]. 苗雪霞.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2004
- [7].嗜线虫致病杆菌北京变种抗生素抗性相关基因的研究[D]. 龚永兴.中国农业科学院2006
- [8].昆虫核型多角体病毒的增效途径和机理[D]. 郭慧芳.南京农业大学2005
- [9].红法夫酵母酶法破壁提取虾青素及其β-环糊精包合的研究[D]. 蹇华丽.华南理工大学2005
- [10].昆虫病原线虫共生菌YL001菌株的代谢产物及其抑菌活性研究[D]. 刘霞.西北农林科技大学2006