Bacillus cereus B-02对Botrytis cinerea抑菌活性及拮抗机制的研究

论文摘要

采用平板培养法和琼脂孔扩散法检测蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B-02的抑菌活性,观察到B-02菌株及其代谢产物对灰霉病致病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）均有明显的、不同程度的抑菌作用,其中,不同稀释浓度Ba.cereus B-02过滤液对Bo.cinerea菌丝生长有明显的抑制作用,并且起主要抑菌作用。在24～48h内B-02可以通过生防菌代谢产物在培养基中的扩散而对靶标真菌形成一定宽度的抑菌带。抑菌带旁的菌丝均不能正常向四周生长,导致菌丝在菌落中央堆积,颜色加深,呈灰褐色或黑褐色。鉴于Ba.cereus B-02胞外物质对病原真菌起主要抑菌作用,因而尝试用分离大分子蛋白质类物质常用的方法——（NH4）2SO4沉淀法和乙醇沉淀法来提取抑菌活性成分,得到的沉淀部分均无抑菌活性,观察到抑菌活性成分仍存在于上清液中。菌株发酵液在121℃高温灭菌30min后对病原菌仍具有较强的抑菌作用,说明B-02抑菌活性成分具有良好的热稳定性。为研究培养条件对Ba.cereus B-02菌株生长和抑菌活性的影响,分别采用分光光度计法、琼脂孔扩散法和杯碟法测定了B-02菌株的菌体量和抑菌活性。系统研究了B-02在不同液体培养基中的生长曲线、pH值和抑菌活性的变化,表明NB培养基较适合于液体摇培,其菌量达到高峰的时期是16h之后且抑菌带宽度达到5mm。同时,B-02菌株在装液量50ml/250ml和接种量1%（0.5ml/50ml）、摇床转速140r/min,32℃,初始pH9.0的NB培养液中振荡培养36h,其代谢产物的抑菌活性作用最为明显,较初始培养条件增加了16.2%。借助光学显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜,从细胞形态学和生理学水平上研究Ba.cereus B-02过滤液对Bo.cinerea的拮抗机理。结果表明,B-02的代谢物质能够明显抑制病菌孢子萌发,一定浓度下可以使菌丝畸形,细胞崩解,内含物外泄,最终导致病菌丧失繁殖能力。处理菌丝表面形态受到严重破坏,发生强烈变形;菌丝细胞核、线粒体和细胞壁等亚细胞结构发生了明显改变,细胞内出现大量无膜透明内含物,并产生较大液泡。此外,处理菌丝DNA、线粒体膜电位和活性氧荧光强度均低于对照组,且差异极显著;说明B-02菌株对病原菌菌丝细胞DNA的合成、线粒体膜电位和活性氧水平有重要影响。

论文目录

摘要

Abstract

第一章、文献综述

1.1 引言

1.2 拮抗细菌防治植物真菌病害的研究进展

1.3 影响拮抗细菌抑菌活性的培养条件

1.4 拮抗细菌对植物真菌病害的防治机理研究进展

1.4.1 拮抗物质的分离纯化及拮抗机理的细胞显微学研究

1.4.2 拮抗菌对病原菌超微形态和超微结构的影响

1.4.3 关于植物病原真菌细胞凋亡的研究

1.5 本论文的研究背景和目的意义

1.5.1 研究背景

1.5.2 研究的目的意义

1.5.3 研究思路

第二章、Bacillus cereus B-02对Botrytis cinerea的抑制作用

2.1 材料与方法

2.1.1 供试材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 B-02菌株发酵液、过滤液、菌体对Botrytis cinerea的抑菌效果

2.2.2 不同浓度Bacillus cereus B-02过滤液对Botrytis cinerea的抑制作用

4）₂SO₄沉淀法处理过滤液'>2.2.3（NH₄）₂SO₄沉淀法处理过滤液

2.2.4 乙醇处理过滤液

2.2.5 热稳定性

2.3 讨论与小结

2.3.1 关于B-02菌株的抑菌活性

2.3.2 关于B-02菌株抑菌活性成分的初步分析

第三章、培养条件对Bacillus cereus B-02生长和抑菌活性的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 供试材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 培养基对B-02菌株生长及抑菌活性的影响

3.2.2 培养时间对B-02菌株生长及抑菌活性的影响

3.2.3 pH值对B-02菌株生长及抑菌活性的影响

3.2.4 温度对B-02菌株生长及抑菌活性的影响

3.2.5 摇床转速对B-02生长及抑菌活性的影响

3.2.6 装液量和接种量对B-02菌株生长及抑菌活性的影响

3.2.7 B-02菌株优化条件与初始条件的对比

3.3 讨论与小结

第四章、Bacillus cereus B-02对Botrytis cinerea拮抗机制的细胞形态学研究

4.1 材料与方法

4.1.1 供试材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 对Botrytis cinerea菌丝形态和孢子萌发的影响

4.2.2 对Botrytis cinerea菌丝外部形态的影响

4.2.3 对Botrytis cinerea菌丝内部结构的影响

4.3 讨论与小结

第五章、Bacillus cereus B-02对Botrytis cinerea拮抗机制的细胞生理学研究

5.1 材料与方法

5.1.1 供试材料

5.1.2 实验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 对Botrytis cinerea菌丝细胞DNA含量的影响

5.2.2 对Botrytis cinerea菌丝内线粒体膜电位的影响

5.2.3 对Botrytis cinerea菌丝内活性氧自由基水平的影响

5.3 讨论与小结

5.3.1 Bacillus cereus B-02可能作用于菌丝细胞的DNA和线粒体

结论

展望

本研究的创新点

参考文献

致谢

在学期间公开发表论文及著作情况

在学期间参加的学术会议及其他

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