龙须草（Eulaliopsis binata）再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化体系研究

论文摘要

禾本科植物龙须草（Eulaliopsis binata）,是研究植物无融合生殖机理的宝贵材料,具有高度的无融合生殖程度和胚乳自主发生等特点。近年来随着研究的深入,一些与无融合生殖相关的基因相继被分离克隆,为了进一步研究这些基因的功能,迫切需要建立龙须草遗传转化体系。本实验以龙须草成熟种子为外植体,研究了影响成熟种子组织培养和植株再生的一些因素,建立了龙须草成熟种子再生体系。同时,以成熟种子诱导的胚性愈伤组织为转化受体,初步研究了影响根癌农杆菌介导的龙须草转化体系的主要因素,为后续建立稳定的遗传转化体系奠定一定基础。主要研究结果如下:1龙须草再生体系的建立（1）愈伤组织诱导:以龙须草4个居群的成熟种子为外植体,筛选龙须草愈伤组织诱导的适宜的2,4-D浓度和居群。结果表明:4个居群的愈伤组织诱导率没有明显差异,对不同浓度的2,4-D的响应情况一致,其中在添加7.0mg/L 2,4-D的MS培养基上,4个居群愈伤组织诱导率都达到较高值,平均诱导率为92.33%,且愈伤组织的生长状态最好。（2）愈伤组织继代和状态改良:通过逐渐降低继代培养基中生长素2,4-D的浓度和添加有机物质等措施,改良初代愈伤。结果表明:2,4-D的浓度由诱导时的7.0mg/L降至2.5mg/L,培养基中添加水解酪蛋白（CH）时,4个居群都能形成黄色或淡黄色,较干燥致密,表面光滑,颗粒明显的胚性愈伤。（3）愈伤组织的分化与植株再生:设计了两种细胞分裂素6-BA、KT和生长素NAA的组合来筛选适宜的愈伤组织分化培养基。结果表明:4个居群的愈伤组织均在添加6mg/L KT和0.2mg/L NAA的MS培养基上获得最高分化率,衡阳居群在4个居群中分化率最高,为42.84%,星子居群的再生率最高,为33.25%。2农杆菌介导的龙须草遗传转化体系的影响因素研究（1）潮霉素筛选浓度的确定:将龙须草胚性愈伤组织转到含有不同浓度潮霉素的继代培养基上观察愈伤组织的生长状况,以确定潮霉素的筛选浓度。结果表明:在本实验中,合适的潮霉素筛选浓度为50mg/L。（2）居群对转化效率的影响:以4个居群成熟种子的胚性愈伤组织为转化受体,比较转化后居群间报告基因（GFP）的瞬间表达率。结果显示:星子居群的GFP瞬间表达率最高,为30%,与其它3个居群的GFP瞬间表达率差异显著,表明星子居群可作为龙须草遗传转化的良好材料。（3）预培养时间对转化的影响:利用星子居群的愈伤组织为转化受体,筛选适宜的预培养时间。结果表明:预培养时间对愈伤转化的影响差异显著,经过3天预培养后,转化率最高为30.62%,是预培养的适宜时间。（4）农杆菌侵染浓度和时间对转化的影响:分别观察统计用不同浓度的农杆菌菌液感染胚性愈伤组织,比较GFP瞬间表达率。结果显示,龙须草转化所需农杆菌菌液的最佳浓度为OD600值0.9。农杆菌的侵染时间低于30min时未见有GFP瞬间表达,适宜的感染时间为45min。（5）共培养时间对转化的影响:分别在共培养2d、3d、4d、5d、6d时检测愈GFP的瞬间表达情况,结果显示:共培养时间低于4天时,GFP的瞬间表达率逐渐上升,第4天时,表达率最高,达到30.49%,当共培养5天及以上时,GFP瞬间表达率降低,因此龙须草遗传转化的最佳共培养时间是4天。（6）转化细胞的筛选:将共培养后愈伤组织首先转移到抑菌培养基上一周,随后转入潮霉素梯度筛选培养基上,在第二次筛选培养基上继代2次后,长出抗性愈伤组织,未转化的细胞死亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 龙须草研究概况
• 1.1.2 植物组织培养技术的发展简史
• 1.1.3 影响植物组织培养过程的主要因素
• 1.1.3.1 外植体
• 1.1.3.2 基因型
• 1.1.3.3 培养基
• 1.1.3.4 培养条件
• 1.1.4 根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究
• 1.1.4.1 根癌农杆菌的研究概况
• 1.1.4.2 根癌农杆菌介导的转基因研究
• 1.1.5 影响农杆菌介导的基因转化的主要因素
• 1.1.5.1 高效稳定的基因转化受体系统
• 1.1.5.2 农杆菌菌株
• 1.1.5.3 预培养
• 1.2.5.4 农杆菌中Vir基因的诱导
• 1.1.5.5 外植体的接种和共培养
• 1.1.5.6 培养基的成分
• 1.1.5.7 渗透处理
• 1.1.5.8 干燥和超声波处理
• 1.1.5.9 转化细胞的选择培养和再生
• 1.1.5.10 外源基因的整合和表达鉴定
• 1.2 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 试验所用菌株和质粒
• 2.2 方法
• 2.2.1 种子处理
• 2.2.2 愈伤组织诱导
• 2.2.3 愈伤组织的继代改良
• 2.2.4 愈伤组织的分化
• 2.2.5 再生苗的生根移栽
• 2.2.6 农杆菌的活化、培养
• 2.2.7 潮霉素有效筛选浓度试验
• 2.2.8 不同居群龙须草对转化的影响
• 2.2.9 预培养对转化的影响
• 2.2.10 农杆菌浸染浓度和时间对转化的影响
• 2.2.11 共培养时间对转化的影响
• 2.2.12 报告基因的瞬间表达检测
• 2.2.13 抗性愈伤组织的筛选
• 2.2.14 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 龙须草再生体系的建立
• 3.1.1 2,4-D浓度对龙须草愈伤组织诱导和生长状态的影响
• 3.1.2 居群间愈伤组织诱导率的差异
• 3.1.3 愈伤组织的继代改良
• 3.1.4 两种激素组合对龙须草愈伤组织分化的影响
• 3.1.5 居群间愈伤组织分化率的比较
• 3.2 农杆菌介导的龙须草遗传转化影响因素的研究
• 3.2.1 潮霉素筛选浓度的确定
• 3.2.2 不同居群之间GFP瞬间转化率的比较
• 3.2.3 预培养对龙须草愈伤组织转化的影响
• 3.2.4 农杆菌液浓度和侵染时间对转化的影响
• 3.2.5 共培养时间对转化的影响
• 3.2.6 抗性愈伤组织的筛选
• 3.2.7 农杆菌介导的龙须草遗传转化基本步骤
• 4 讨论与结论
• 4.1 龙须草再生体系的建立和优化
• 4.1.1 2,4-D浓度对龙须草愈伤组织诱导和继代的影响
• 4.1.2 非激素外源添加物对龙须草愈伤组织生长的影响
• 4.1.3 不同激素组合对龙须草愈伤组织分化的影响
• 4.1.4 居群（基因型）对龙须草组织培养的影响
• 4.2 根癌农杆菌介导的龙须草遗传转化的影响因素
• 4.2.1 龙须草居群对农杆菌介导的遗传转化的影响
• 4.2.2 农杆菌菌液浓度和侵染时间对龙须草转化的影响
• 4.2.3 预培养和共培养基的成分及培养时间对龙须草转化的影响
• 4.2.4 影响转化的其它因素
• 4.2.5 关于龙须草转化体系建立的展望
• 参考文献
• 图版及图版说明
• 图版Ⅰ
• 图版Ⅱ
• 致谢