诱导超敏反应增强辣椒广谱抗病性的转基因研究

论文摘要

青枯菌（Ralstonia solanacearum）是引起包括辣椒在内的多种重要作物青枯病的病原细菌。青枯菌通过T3S（Ⅲ型分泌系统）、T2S（Ⅱ型分泌系统）等将多种毒性因子输送到胞外使植物致病。转基因抗病、培育抗性品种和生物防治是防治青枯病的主要途径。转基因抗病中,常存在转基因作物抗性范围过窄、抗性不稳定、发育异常、产量下降等不足。使用诱导型启动子来调控广谱抗性基因表达,通过诱发超敏反应提高植物抗病性是理想的基因工程策略。遗传转化体系的建立是作物抗病基因工程的前提。保加利亚尖椒12d龄子叶在MB+29.41μmol/L AgNO3+15.54-22.20μmol/L 6-BA+2.85-5.71μmol/L IAA+75-100μmol/L Spd+1.14μmol/L ABA+5.0 mL/L PSJ,87.64 mmol/L蔗糖,pH 5.8的培养基中培养容易得到高质量的不定芽。辣椒幼苗汁液对不定芽的诱导分化及伸长有明显的促进作用,添加脱落酸和亚精胺可促进不定芽伸长。本再生体系中,不定芽诱导率达100%,不定芽伸长率达83%,生根率达到100%。将农杆菌侵染后的子叶置于暗处共培养4d,直接转移到含Kam100 mg/L、Cef 500 mg/L的选择分化培养基,并连续照光1周,转化植株阳性率达75%。按GenBank中受病原物诱导的植物启动子（pathogen-inducible plant promoters,PPPs）的碱基序列设计3对引物,从烟草基因组中扩增到3个启动子,PPP1、PPP2和PPP3。用PPPs替换pBI121中与gus基因相连的35S启动子,再将重组质粒导入农杆菌GV3101,构建了PPPs和gus相连的转化单元。通过农杆菌介导法将受PPPs控制的gus基因导入辣椒。转基因辣椒叶片接种青枯茵24h后,检测到GUS活性显著上升。表明转基因辣椒中PPPs能受青枯菌的诱导。将PPP3和pUC 19连接后转化E.coli DH5a,通过蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落。双酶切PPP3和含目的基因（pflp或hrap）的pBI121质粒,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coli DH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,筛选PPP3和目的基因正确连接的重组质粒。从重组质粒扩增出PPP3+pflp+nos片段,酶切后插入到PPP3+hrap+nos片段前的HindⅢ位点,再将重组质粒转化农杆菌GV3101,PCR检测可扩增到pflp+nos+PPP3+hrap片段,表明两价诱导表达载体构建成功。经农杆菌介导法用两价诱导表达载体转化辣椒,得到了转基因植株。经PCR和Southern blotting证明pflp和hrap基因成功插入到辣椒基因组并能遗传给子一代。RT-PCR结果显示,在PPP3的控制下pflp和hrap有一定的本底表达量。以actin作内参基因,实时荧光定量PCR分析转基因植株子一代接种青枯菌前后目的基因表达量的变化,发现接种后pflp基因转录效率提高到原来的13.08倍,hrap基因转录效率提高到原来的9.93倍。说明受青枯菌诱导后,PPP3控制的pflp基因和hrap基因转录效率显著升高。灌根接种青枯菌,转基因植株无明显致病表现。转基因辣椒叶片接种青枯菌后,接种部位表现出明显的超敏反应。转基因辣椒受青枯菌诱导后,H2O2含量的增幅为27.4%,SOD活性增幅为55.2%,PPO活性增幅为66.0%,CAT活性降低了21.3%,MDA含量降幅为9.2%。灌根接种疫霉菌孢子,转基因植株表现出发病延迟、病情进展缓慢等抗病特点。说明受青枯菌诱导时PPP3启动pflp和hrap高效表达,并通过引发超敏反应增强了辣椒对青枯病和疫病的抗性。与非转基因植株相比,转基因辣椒叶绿素含量降低了15.6%,不同转基因植株间光合速率相差较大,分别为对照的84.9%、93.4%、99.6%,但都小于对照植株。从表型看,转基因植株生长缓慢、株高变矮、叶面积变小、开花延迟,说明外源基因的插入及表达对辣椒的生长发育有一定的不良影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1. 研究目的及意义
• 2. 青枯病危害及致病机理
• 2.1 T3S与青枯菌的致病性
• 2.2 T2S与青枯菌的致病性
• 2.3 其它因素与青枯菌的致病性
• 3. 抗青枯病的主要途径
• 3.1 转基因抗病
• 3.2 培育抗病品种
• 3.3 青枯病的生物防治
• 4. 植物抗病机制
• 5 植物转基因抗病策略
• 5.1 病原物诱导型启动子应用
• 5.2 寻找病原物诱导型启动子
• 5.3 病原物诱导型启动子应用
• 5.4 病原物诱导型启动子应用的局限性
• 5.5 融合启动子研究
• 6 超敏反应与植物抗病
• 7 辣椒组织培养及转基因抗病进展
• 7.1 辣椒器官发生
• 7.2 辣椒体细胞胚胎发生
• 7.3 辣椒原生质体培养和单倍体培养
• 7.4 辣椒不定芽的伸长
• 7.5 辣椒遗传转化的研究
• 8 超敏反应相关基因的诱导表达提高植物广谱抗病力
• 第二章 辣椒高效遗传转化体系的建立
• 1. 材料、培养基及菌株
• 1.1 种子消毒及无菌苗的培养
• 1.2 辣椒幼苗汁液（pepper seedling juice，PSJ）的获得
• 1.3 培养基及培养条件
• 1.4 农杆菌菌株
• 2. 方法
• 2.1 不定芽的诱导
• 2.2 不定芽的伸长
• 2.3 幼苗的生根与移栽
• 2.4 辣椒对卡那霉素和对头孢霉素的抗性水平检测
• 2.5 农杆菌转化辣椒的研究
• 2.6 转基因植株检测
• 3 结果
• 3.1 不定芽的诱导
• 3.2 不定芽的伸长
• 3.3 生根与栽培
• 3.4 辣椒子叶对卡那霉素和头孢霉素的敏感性水平检测
• 3.5 转基因植株中NPTII基因的检测
• 4 讨论
• 第三章 受病原物诱导的植物启动子PPPs在转基因辣椒中的活性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料、菌株和质粒
• 1.2 启动子的克隆和测序
• 1.3 转化单元的构建
• 1.4 辣椒转基因方法
• 1.5 转基因植株检测
• 1.6 GUS活性检测
• 2. 结果与分析
• 2.1 转化单元的构建
• 2.2 转基因植株的获得和鉴定
• 2.3 青枯菌的分离
• 2.4 转基因植株GUS活性的诱导表达
• 3. 讨论
• 第四章 植物两价诱导表达载体的构建
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料、菌株和质粒
• 1.2 方法
• 1.3 PCR引物、工具酶、试剂盒及测序
• 2. 结果与分析
• 2.1 PPP3的扩增
• 2.2 细菌诱导型启动子的克隆
• 2.3 植物单价诱导表达单元中间载体的构建
• 2.4 两价诱导表达载体的构建
• 3 讨论
• 第五章 两价诱导表达载体转化辣椒及检测
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料、菌株和质粒
• 1.2 辣椒转基因方法
• 1.3 分子试剂
• 1.4 Southern杂交实验
• 2. 结果
• 2.1 转基因植株目的基因检测
• 2.2 探针合成及探针合成效率检测
• 2.3 转基因抗性苗中目的基因PCR-Southern检测
• 3. 讨论
• 第六章 目的基因表达分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 RNA提取及RT-PCR
• 1.3 实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,QPCR）
• 2. 结果与分析
• 2.1 目的基因的诱导表达分析
• 2.2 实时定量PCR分析目的基因的诱导表达
• 3. 讨论
• 第七章 转基因辣椒抗病性分析及光合速率测定
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 青枯菌分离和接种
• 1.3 酶活性测定
• 1.4 青枯病抗性观察
• 1.5 疫霉菌接种及抗性观察
• 1.6 叶绿素含量测定
• 1.7 光合速率测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 转基因辣椒青枯菌抗性分析
• 2.2 转基因辣椒对疫霉菌抗性观察
• 2.3 转基因辣椒生长发育及光合特征变化
• 3. 讨论
• 结论
• 本文主要创新点
• 后续研究思路
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介
• 攻读学位期间取得的学术成果