β arestins转基因小鼠制备、建系及功能研究初探

论文摘要

在G蛋白偶联受体（GPCRs,7TMRs）信号转导中,经典的理论认为β—arrestins使激活的受体与G蛋白解偶联（脱敏）,阻断了受体信号转导,进而导致受体内吞。近来的研究发现β—arrestins不仅终止GPCRs的信号,还可以介导GPCRs的内吞和运输,引发GPCRs的新信号,以及介导GPCRs和其它信号通路间的交流。为了更进一步研究β-arrestins在活体水平上的功能定位,我们运用转基因技术,通过体外构建目的基因载体,原核期胚胎的显微注射,再进行PCR和Southern Blot鉴定,最终制备了human β arrestin Ⅰ overexpression mice, human β arrestin Ⅱ overexpression mice, mouse β arrestin Ⅰ RNAi mice和mouse β arrestin Ⅱ RNAi mice四种转基因鼠。经过实时荧光定量PCR鉴定纯合小鼠。自此,系统便初步建立起来。然后,我们进行RT-PCR和免疫组化试验,进行蛋白表达鉴定。阿片受体属于GPCRs超家族。因此体内过量表达β—arrestins有可能引起阿片成瘾的变化。于是我们采用甩尾法研究转基因小鼠对吗啡耐受的变化。由于海马区外源基因的表达,我们运用开场行为和Morris水迷宫实验证明其对空间记忆的影响。

论文目录

• 引言
• 第一章 hβarrestin Ⅱ overexpression转基因小鼠的制备和纯合子的建立
• 一、材料与方法
• （一） 材料
• 1. 质粒
• 2. 工具酶
• 3. 主要生化试剂
• 4. Sourthern杂交试剂
• 5. 其他分子生物学仪器
• （二） 方法
• 1. Arr2O小鼠载体的构建和显微注射用 DNA的制备
• 2. 显微注射
• 3. 小鼠基因组 DNA的提取
• 4. 转基因阳性鼠鉴定
• 4.1 PCR筛选
• 4.2 Southern杂交
• 5. Arr2O小鼠的蛋白表达鉴定
• 5.1 RT-PCR鉴定
• 5.2 免疫组化鉴定
• 6. 用实时荧光定量 PCR的方法鉴定纯和转基因鼠
• 二、结果与讨论
• （一） 结果
• 1. 显微注射用 DNA的制备
• 2. 显微注射与转基因鼠建立
• 3. 转基因鼠的 PCR鉴定
• 4. 转基因鼠的 Southern杂交鉴定
• 5. RT-PCR鉴定基因转录情况
• 6. 免疫组化分析转基因蛋白表达的情况
• 7. Realtime PCR鉴定纯合子
• （二） 讨论
• 第二章 转基因小鼠的功能研究
• 第一节 阿片成瘾作用探讨-tolerance（tail flick）
• 一、材料与方法
• （一） 材料
• 1. 实验动物和分组
• 2. 仪器
• （二） 方法
• 1. 急性吗啡甩尾实验
• 2. 长时吗啡甩尾实验
• 二、结果与讨论
• （一） 结果
• 1. 急性吗啡耐受
• 2. 长时吗啡耐受
• （二） 讨论
• 第二节 转基因小鼠的自主活动和空间记忆研究
• 一、材料与方法
• （一） 材料
• 1. 实验动物和分组
• 2. 仪器
• （二） 方法
• 1. 自主活动测定
• 2. 空间记忆的研究--Morris水迷宫
• 二、结果与讨论
• （一） 结果
• 1. 自主活动
• 2. Morris水迷宫
• （二） 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 在读期间发表的文章
• 致谢