论文题目: B型烟粉虱热休克蛋白基因的克隆和表达及其与胁迫耐受性关系的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 农业昆虫与害虫防治
作者: 王海鸿
导师: 雷仲仁
关键词: 型烟粉虱,热休克蛋白,文库,胁迫耐受,实时定量
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: B型烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一种世界性的重要农业害虫,该害虫自20世纪90年代入侵我国以来,已给我国的农业生产和国民经济造成巨大损失。已有的研究表明B型烟粉虱的成功入侵,与该入侵种群对土著昆虫的竞争取代密切相关;B型烟粉虱抗药性的形成在其入侵过程中也起到了重要的作用。本文通过研究与粉虱胁迫耐受性密切相关的热休克蛋白(Hsps),比较了不同生物型烟粉虱之间、B型烟粉虱与近缘种温室白粉虱之间以及对农药抗性和敏感烟粉虱之间胁迫耐受性的差异。探讨了生态适应性在B型烟粉虱成功入侵中的作用。分析了Hsps在生态与进化研究中的应用。本研究的主要内容以及取得的初步成果如下: (1)成功构建了B型烟粉虱热胁迫cDNA文库,未扩增的原始文库容量3.5×10~6,从文库中筛选到的热休克蛋白Hsp70和Hsp90的基因序列含有5’端、ORF和3’端,说明文库的代表性和完整性较好;此外通过用蓝白斑筛选和PCR方法检测噬菌斑内置质粒,表明文库重组率为98.9%,插入片段长度在800bp-2,500bp之间,满足了筛选普通基因cDNA序列的要求,为研究B型烟粉虱与生态适应相关基因奠定了基础。 (2)首次成功克隆出11条编码粉虱Hsps的完整或部分cDNA片段,并递交GenBank,登录号分别为DQ093377、DQ093378、DQ093379、DQ093380、DQ093381、DQ093382、DQ093383、DQ093384、DQ093385、DQ093386和DQ093387。其中有两条完整的cDNA序列,其一为编码Hsp70基因的cDNA序列,该序列全长2207bp,含有1904bp的完整开放阅读框,编码一个644氨基酸的蛋白,计算分子量为70kDa,推导出的氨基酸序列具有70kDa热休克蛋白家族的全部3个签名序列;另一个为编码Hsp90基因的cDNA序列,该序列全长2440bp,含有2163bp的开放阅读框,编码一个721氨基酸的蛋白,计算分子量为83kDa,推导出的氨基酸序列具有90kDa热休克蛋白家族的全部5个签名序列:其余的cDNA片段推导的氨基酸序列均具有部分热休克蛋白家族的签名序列。 (3)成功构建了B型烟粉虱Hsp70和Hsp90的原核表达载体pET21-Hsp70和pET21-Hsp90,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行了表达。用IDA树脂对蛋白进行了纯化,免疫兔子制备了高度专一性的抗体。通过Western杂交研究了热休克蛋白表达的时滞性,杂交结果表明:在43℃胁迫30min后的3个小时内,B型烟粉虱的Hsp70蛋白表现为逐渐累积,Hsp90未观察到有明显变化。 (4)建立了检测粉虱Hsps表达差异的实时定量RT-PCR体系。比较和分析了B型与本土China-ZHJ-1型烟粉虱Hsps的胁迫诱导表达情况。在受到4℃、7℃、10℃和13℃的低温胁迫时,B型烟粉虱体内Hsps的诱导表达水平均超过了China-ZHJ-1型烟粉虱,B型Hsp70的最大诱导水平达到8.1倍,而China-ZHJ-1型仅为3.3倍;二者对极端高温的耐受性相似。因此,从对极端温度的耐受能力来看,B型烟粉虱有着较宽的温度生态幅,为关于入侵生物理论的假设提供了有力的实验证据,同时也为B型烟粉虱能在我国南方和北方同时发生猖獗为害,而China-ZHJ-1型的发生范围仅限于南方提供了一些分子生态证据。 (5)运用实时定量RT-PCR体系比较了先后入侵我国的两种粉虱近缘种—B型烟粉虱和温室白粉虱。高温胁迫诱导B型烟粉虱产生Hsps的阈值范围远远超过了温室白粉虱,B型烟粉虱在43℃时仍能大量表达Hsps,而在40℃时,温室白粉虱Hsps的表达水平已降到与未诱导水平相似的程度;在受低温胁迫时,温室白粉虱能在更低的温度(7℃)下产生最大量的Hsps,而B型烟粉虱产生最大量Hsps的温度为10℃。在接受短期冷驯化的锻炼后,二者在检测低温下Hsps的诱导水
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 我国农业外来入侵昆虫的现状及存在问题
1.2 烟粉虱研究概况
1.3 B-型烟粉虱入侵机制研究
1.4 热休克蛋白研究进展
1.5 本研究拟解决的问题
1.6 本研究的创新点
第二章 B-型烟粉虱cDNA文库的构建及热休克蛋白基因的克隆
2.1 材料
2.1.1 供试昆虫
2.1.2 质粒与细胞菌株
2.1.3 主要实验试剂
2.1.4 部分试剂的配制
2.2 实验方法
2.2.1 烟粉虱成虫热激条件下cDNA文库的构建
2.2.2 cDNA文库的鉴定和扩增
2.2.3 Hsp70和Hsp90基因探针序列的确定
2.2.4 筛选cDNA文库
2.2.5 检测阳性克隆
2.2.6 China-ZHJ-1型烟粉虱及温室白粉虱热休克蛋白片段的克隆
2.3 结果与分析
2.3.1 cDNA文库的构建
2.3.2 cDNA重组率的计算和容量的鉴定
2.3.3 用作探针目标片段的克隆测序
2.3.4 DIG标记探针效率的确定
2.3.5 cDNA文库筛选的结果与分析
2.3.6 编码China-ZHJ-1型烟粉虱和温室白粉虱热休克蛋白基因片段的克隆
2.4 讨论
第三章 热休克蛋白基因的表达和重组蛋白的纯化与鉴定
3.1 材料
3.1.1 菌种和质粒
3.1.2 主要化学试剂
3.2 仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 表达蛋白引物设计
3.3.2 Hsp70和Hsp90融合表达载体的构建
3.3.3 连接产物的转化、鉴定
3.3.4 细胞培养和诱导表达
3.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳
3.3.6 表达蛋白菌液的上柱前处理
3.3.7 His·Tag融合蛋白纯化
3.3.8 Western blot杂交
3.4 结果与分析
3.4.1 Hsp90和Hsp70融合表达载体的构建
3.4.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
3.4.3 带有His·Tag序列的蛋白纯化
3.4.4 Western-blot分析
3.5 讨论
第四章 粉虱Hsps差异表达及与生态适应性间关系的研究
4.1 材料
4.2 实验方法
4.2.1 RNA分离、反转录与质量检测
4.2.2 作为内参照的看家基因的选择
4.2.3 实时定量RT—PCR体系的优化
4.2.4 数据分析
4.2.5 对粉虱的胁迫处理
4.2.6 Hsps蛋白表达差异的检测
4.3 结果
4.3.1 RNA质量评估
4.3.2 评估做为内参的看家基因
4.3.3 实时定量RT-PCR反应体系的优化
4.3.4 对不同胁迫处理粉虱Hsps表达差异的检测
4.4 讨论
4.4.1 热休克蛋白表达差异研究方法
4.4.2 B型与非B型烟粉虱胁迫耐受能力
4.4.3 B型烟粉虱与温室白粉虱对极端温度胁迫的耐受能力
4.4.4 烟粉虱的抗药性
4.4.5 Hsps在生物胁迫耐受性研究方面的应用
第五章 结论
5.1 成功构建了B型烟粉虱热胁迫cDNA文库
5.2 首次成功克隆出11条编码粉虱Hsps的完整或部分cDNA片段
5.3 成功构建了B型烟粉虱Hsp70和Hsp90基因融合表达载体
5.4 建立了检测粉虱Hsps表达差异的实时定量RT-PCR体系
5.5 发现粉虱同一种内入侵种群与非入侵种群在胁迫耐受性上的差异
5.6 从分子角度探讨了两种入侵近缘种在我国种群季节消长和分布区域差异的原因
5.7 研究了Hsps的诱导表达与烟粉虱抗性的关系
5.8 探讨了Hsps在生态适应研究中的应用
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-09-05
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