论文摘要
背景:皮肤是人体面积最大的器官,是机体与外界的机械屏障,具有复杂的组织结构和多重生理功能。创（烧）伤后皮肤缺损或是糖尿病等慢性病所致顽固性皮肤溃疡是临床常见病症之一,及时有效的创面修复是此类患者救治的基础和核心问题。随着组织工程学的拓展,应用干细胞技术有望为创面修复提供新的手段。近年来,骨髓间充质干细胞在创伤修复方面的作用日益受到各国学者的广泛关注。骨髓间充质干细胞具有高度自我更新能力以及多向分化潜能,多项体内外研究已证实其可以分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞等多种组织细胞。越来越多的学者倾向认同,骨髓间充质干细胞能够跨胚层分化为表皮细胞参与创面修复。然而,目前研究主要集中在骨髓间质干细胞的分化结果上,对于分化中的信号调控机制研究甚少,骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的机制尚不明确,缺乏有效调控手段。探索有效的骨髓间充质干细胞分化调控药物,提高骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化效率,无疑对治疗大面积皮肤缺损或是慢性难愈性创面具有重要临床意义和广阔应用前景。法舒地尔,英文名为Fasudil,别名为HA1077,化学名为六氢-1-（5-磺酰基异喹啉）-1（H）-1,4-氮杂,是日本旭化成株式会社和名古屋大学药理学研究室合作开发的一种新型异喹啉磺胺衍生物。盐酸法舒地尔为细胞内Ca2+拮抗剂,蛋白激酶抑制剂。其主要用途是用来改善和预防由多种原因引起的脑血管痉挛,选择性扩张痉挛的脑血管,改善脑缺血症状及伴随的神经元损伤。盐酸法舒地尔为Rho激酶特异性抑制剂,它主要是通过抑制Rho激酶活性而发挥其药理作用。Rho蛋白是细胞的转导通路的信号转换器或分子开关,Rho激活的信号传递与JNK、P38通路有关,而本实验室前期研究已证实ERK、p38两条信号通路与大鼠骨髓间充质干细胞诱导向表皮细胞分化相关。由此推测,法舒地尔极有可能参与骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的调控。基于以上认识,本研究深入探讨了骨髓间充质干细胞、盐酸法舒地尔与皮肤创面修复之间的关系。目的:1.探讨HA1077阻断Rho信号对骨髓间充质干细胞表达角蛋白的影响。2.探讨HA1077对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向表皮细胞表型诱导中细胞周期的影响。3.观察HA1077在大鼠皮肤创面愈合中的作用,探讨最佳HA1077促愈浓度。4.观察HA1077联合骨髓间充质干细胞在难愈创面治疗中的作用方法:1.体外原代培养大鼠MSCs,纯化、鉴定、传代扩增。取第3代MSCs,分为正常对照组、单纯诱导组、Rho阻断组,于第1、3、5、7天应用流式细胞仪检测MSCs定向诱导中磷酸化P38和ERK表达;观察诱导后第7天各组细胞CK5/8、CK19的阳性表达率;观察2种浓度（10μmol/L,30μmol/L）HA1077阻断后,MSCs的CK5/8、CK19阳性表达率。2.体外原代培养hMSCs,纯化、鉴定、传代扩增。取第3代hMSCs,体外诱导hMSCs向表皮细胞表型分化,分为正常对照组、单纯诱导组、Rho阻断组3组。应用流式细胞仪检测各组细胞诱导7天后hMSCs细胞周期和增殖细胞核抗原（PCNA）变化。3.建立大鼠背部皮肤全层缺损模型,分为实验组和对照组,实验组分别用10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L浓度梯度的盐酸法舒地尔注射液治疗大鼠皮肤缺损创面,对照组创面喷洒氯化钠溶液。观察各组动物创面愈合情况,并于创伤后第10天取创面组织进行组织学检查。4.体外分离培养自体骨髓间充质干细胞,纯化、鉴定、传代扩增。临床病人慢性创面分为对照组、单纯HA1077组、HA1077联合细胞移植组,观察各组创面愈合情况。结果:1.磷酸化P38表达:正常对照组的磷酸化P38为0.02±0.009%;单纯诱导组诱导后第5天p38磷酸化水平较对照组增高,差异有统计学意义;Rho阻断组,磷酸化P38水平在第1天至第7天较对照组和单纯诱导组均呈升高,差异有统计学意义。2.磷酸化ERK表达:正常对照组的磷酸化ERK水平为4.15±0.32%;单纯诱导组诱导后第3天至第5天磷酸化ERK表达均呈下降趋势低于对照组,差异有统计学意义,第7天时恢复至诱导前水平;Rho阻断组,ERK磷酸化水平第1天至第5天无明显变化,第7天时低于对照组和单纯诱导组,差异有统计学意义。3.骨髓间充质干细胞角蛋白表达:诱导后第7天,对照组CK5/8阳性率为0.58±0.01%,CK19阳性率为2.04±0.13%;单纯诱导组CK5/8为1.81±0.05%,CK19为10.19±0.23%; Rho阻断1组（10μmol/L）:CK5/8为21.65±0.75%,CK19为39.41±0.86%,与单纯诱导组相比,升高显著,P<0.01;Rho阻断2组（30μmol/L）:CK5/8为21.07±0.57%,CK19为45.60±0.91%,较之单纯诱导组升高显著,P<0.01;两种HA1077 Rho阻断浓度对提高MSCs向表皮细胞分化效率差异不显著。4.细胞周期检测结果显示,诱导第7天,对照组、诱导组和Rho阻断组各组处在G0/G1期的细胞分别为（92.32±0.32）%、（88.76±0.55）%、（79.60±1.99）%,各组间差异有统计学意义;各组处于S期的比例分别为:（8.10±0.54）%、（12.92±0.28）%、（19.22±0.89）%,各组间差异有统计学意义。5.诱导第7天,对照组、诱导组、HA1077阻断组PCNA的阳性表达率分别为:（ 4.28±0.96）%、（8.92±2.23）%、（11.23±0.89）%,其中HA1077阻断组PCNA的阳性表达率最高,各组间差异有统计学意义。6. 20μmol/L HA1077组创面剩余面积明显小于同时间点其他各组,除创伤后第7天与80μmol/L组剩余创面面积比较差异无显著性外,其余各时间点差异均有显著性（P<0.05）。7.创面组织学检查显示显示,创伤后第10天,创面肉芽组织明显增多,应用不同剂量HA1077治疗的各组均比对照组肉芽形成明显,且新生毛细血管丰富,创缘有新生表皮生成;应用20μmol/L HA1077组创面新生肉芽组织生长及新生表皮速度明显优于其他组别。8.在治疗后第7天,对照组、单纯HA1077组、HA1077联合细胞移植组的创面愈合指数分别为5.22±5.26、6.86±5.38和9.33±8.23;在治疗第14天,各组创面愈合指数分别为10.29±8.75、13.35±10.57和36.32±9.92, HA1077联合细胞移植组创面愈合情况均优于单纯HA1077组和对照组,差异有统计学意义,而单纯应用HA1077组与对照组在各个观察时相点创面愈合情况差别不大。结论:1.在本实验诱导条件下,上游信号Rho对p38途径起反向调节。阻断Rho,可以提高p38的信号磷酸化水平。应用HA1077将上游信号Rho阻断后可增加p38途径激活,在一定程度上促进MSCs分化,表达角蛋白CK5/8、CK19阳性率增加。2. HA1077在体外条件诱导下能促进hMSCs进入S期,PCNA表达增加,使hMSCs增殖能力提高,分化能力增强。PCNA的上调可能参与了MSCs的向表皮细胞的转分化过程,促进hMSCs向表皮细胞表型的分化。3.研究表明HA1077可促进皮肤缺损创面愈合;20μmol/L HA1077为最佳创面促愈浓度。4.结果提示HA1077可以促进MSCs细胞修复慢性皮肤创面。HA1077联合骨髓间充质干细胞治疗难愈性创面具有良好临床应用前景。
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- [1].HA1077联合骨髓间充质干细胞治疗难愈创面观察[J]. 武警医学 2009(03)
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