论文摘要
新孢子虫病（Neosporiasis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生于犬、牛、马、羊等多种宿主动物细胞内而引起的一种原虫病。该病对牛的危害尤为严重,主要造成孕畜流产、死胎以及新生犊牛的运动神经系统疾病,已给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。国外学者在新孢子虫的致密颗粒棒状体内以及速殖子表面发现了新孢子虫表面蛋白NcSRS2,NcSRS2表面蛋白介导其粘附及入侵宿主细胞,可以作为酶联免疫吸附试验有效的抗原成分,是最有希望的新孢子虫疫苗的侯选抗原。本研究利用PCR技术扩增和克隆了1 100bp犬新孢子虫吉林株NcSRS2基因片段,对所克隆的NcSRS2基因序列与基因库中已发表的序列（AY940488）进行比较分析。结果表明同源性达到99.8%,证明了该基因片段为犬新孢子虫NcSRS2基因。将NcSRS2基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,经PCR鉴定及酶切鉴定,证明成功构建了融合表达载体pGEX-NcSRS2。将构建好的融合表达载体,在1mmol/L的IPTG诱导下,在大肠杆菌BL21中得到大量表达,经过8 h表达量达到高峰。融合蛋白GST-NcSRS2的分子量为64.4 ku,大部分以可溶性蛋白的形式存在。用亲和层析方法对GST-NcSRS2融合蛋白进行了纯化,获得了理想的纯化结果。经Western blotting免疫印迹分析,融合蛋白与犬新孢子虫阳性血清发生特异性反应,而同刚地弓形虫阳性血清没有交叉反应,说明该蛋白具有很好的抗原性和特异性。本研究应用纯化后的GST-NcSRS2融合蛋白建立了检测犬新孢子虫抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原浓度为4μg/mL、被检血清稀释度为1:40、酶标二抗稀释度为1:2 000为最佳工作浓度。该方法不与牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、牛巴贝斯虫等阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法与玄学南等建立的间接ELISA方法平行检测128份牛血清样本,结果表明,所建立方法更加敏感,说明建立的ELISA适用于犬新孢子虫抗体的检测。
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摘要Abstract引言1 新孢子虫病原学研究进展2 新孢子虫病流行病学及危害3 新孢子虫病防治研究进展3.1 临床诊断3.2 病理组织学检查3.3 血清学诊断3.4 分子生物学诊断方法3.5 动物接种试验4 新孢子虫主要抗原研究进展4.1 表面抗原4.2 微线抗原4.3 颗粒抗原5 牛新孢子虫疫苗的应用研究5.1 免疫预防的应用前景5.2 活疫苗与死疫苗5.3 牛新孢子虫疫苗的应用研究6 本研究目的及意义材料与方法1 材料1.1 病料来源1.2 虫体培养所用材料1.3 载体与菌株1.4 主要试剂1.5 试验所用溶液及其配制1.6 主要仪器设备2 方法2.1 犬新孢子虫吉林株虫体的分离与鉴定2.2 PCR产物的回收2.3 感受态细胞的制备（CaCl2法）2.4 NcSRS2 DNA与pWD18-T Simple Vector的重组连接2.5 重组连接后质粒DNA的转化2.6 重组克隆的筛选2.7 质粒DNA的小量制备（碱性裂解法）2.8 重组质粒的鉴定2.9 序列测定及分析2.10 重组表达载体的构建2.11 重组表达载体的鉴定2.12 重组融合表达质粒的诱导表达2.13 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.14 融合蛋白Western-blotting分析2.15 重组蛋白的大量表达2.16 包涵体的鉴定2.17 亲和层析法纯化融合蛋白（Batch法）2.18 ELISA诊断方法的建立结果1 犬新孢子虫吉林株虫体的分离与鉴定2 目的基因的克隆及重组质粒的鉴定3 pMD18-T-NcSRS2重组质粒的序列测定及同源性分析4 重组表达载体的构建及鉴定5 重组表达质粒的序列测定及分析6 重组表达载体pGEX-NcSRS2的表达7 融合蛋白Western-blotting分析8 蛋白存在形式的鉴定9 重组蛋白的亲和层析纯化10 以重组蛋白NcSRS2为抗原的ELISA试验讨论1 犬新孢子虫吉林株的分离与鉴定2 新孢子虫病的诊断3 目的基因的扩增与克隆4 表达载体pGEX-4T-25 重组表达质粒的构建和鉴定6 NcSRS2重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达7 以重组NcSRS2蛋白为抗原的ELISA试验结论参考文献致谢作者简介附录 （攻读学位期间发表论文目录）
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标签：犬新孢子虫吉林株论文; 基因片段论文; 表达论文; 反应原性论文; 间接论文;
犬新孢子虫吉林株NcSRS2基因片段的原核表达及初步应用
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