病毒感染与多发性硬化的临床和实验室研究

论文摘要

第一部分 多发性硬化患者血清和脑脊液中常见病毒抗体／抗原的检测 [目的] 检测多发性硬化患者（MS）血清和脑脊液（CSF）中几种常见的可能与MS发病有关的病毒抗体和／或抗原的情况，并与其他神经科疾病患者（OND）和非神经科疾病患者（NND）的结果进行比较分析。 [方法] 多发性硬化组（MS组）65例，均符合Poser诊断标准。男23例，女42例；年龄18～62岁，平均42.5±6.82岁；病程1～20年，平均3.6±8.4年。其中复发缓解型40例、复发进展型9例、原发进展型7例、继发进展型9例，本组的MS患者均在发作期，住院前2个月未用糖皮质激素和免疫抑制剂。其他神经科疾病组（OND组）71例，男30例，女41例；年龄17～65岁，平均45.4±7.34岁；其中运动神经元病20例、帕金森病5例、重症肌无力3例、周围神经病19例、头痛8例、癫痫12例、神经症4例。非神经科疾病组（NND组）42例，为妇科、泌尿外科和血管外科疾病住院的手术腰麻患者。男18例，女24例；年龄18～70岁，平均48.2±5.02岁。每例患者取静脉血3ml，脑脊液2ml。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测三组每例患者血清和CSF中乙型肝炎病毒（HBV）HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HbcAb；EB病毒（EBV）早期抗原（EA，包含p138和p54两种早期蛋白质）、壳抗原（VCA）、核抗原（EBNA复合物）的IgG抗体；人类疱疹病毒6（HHV-6）的IgG抗体；单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-I）的IgG和IgM抗体；丙型肝炎病毒（HCV）的抗体。统计学检验用X2检验和Fisher精确检验。 [结果] 1)MS组血清HBV感染的阳性人数为50人，感染率76.92％；OND组阳性30人，感染率42.25％；NND组阳性20人，感染率47.62％。MS组的HBV总感染率高于OND组和NND组，有统计学差异（均P＜0.05）。血清HBsAb，HBeAg的阳性率和HBsAg，HBeAg，HbcAb同时阳性的比例，MS组都高于OND组和NND组，有统计学差异（均P＜0.05）。2)MS组血清EB病毒EA IgG抗体阳性30例（46.15％），OND组阳性13例（18.31％），NND组阳性4例（9.52％），三组比较，MS组阳性率显著高于OND组和NND组，有统计学差异（均P＜0.05）。EB病毒EBNA复合物和VCA的IgG抗体的阳性率三组无显著性差异（均P＞0.05）。3)三组血清中HHV—6 IgG抗体阳性率无统计学差异（均p＞0.05）。4)血清中HSV-I IgG抗体三组无统计学差异（均P＞0.05）。MS组HSV-I IgM抗体有53例阳性，阳性率为81.53％；OND组有30例阳性，阳性率42.25％；NND有22例阳性，阳性率为52.38％。MS组阳性率高于OND组和NND组，有统计学差异（均P＜0.05）。5)三组血清中HCV抗体的测定结果无统计学差异（均P＞0.05）。6)在脑脊液中所有病毒抗体／抗原的结果，三组均无统计学差异（均P＞0.05）。 [结论] 1)MS组与其他两组比较，血清中HBV总感染率，HBsAb，HBeAg的阳性率和血清HBsAg，HBeAg，HBcAb同时阳性（俗称大三阳）的比例显著高，有统计学差异（均P＜0.05）。说明MS组HBV感染率高，部分病人病毒活跃复制。2)MS组EBV的EA IgG抗体阳性率升高，与OND组和NND组比较，有统计学差异（均P＜0.05）。提示发作期的MS患者常有活动性的EBV感染。3)MS组血清中HSV-I IgM抗体阳性率明显高于其他两组（均P＜0.05），提示大部分发作期MS患者有新近的HSV-I感染或潜伏的HSV-I的重新活化。 第二部分 合成病毒多肽诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的研究 一．用生物信息学方法选择病毒多肽抗原 [目的] 用生物信息学（Bioinformatics）的方法检索与多发性硬化发病可能相关的几种常见病毒的氨基酸序列与神经髓鞘主要成分—髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）是否有相同或相似的序列，并明确具体氨基酸顺序，为分子模拟学说提供理论依据。 [方法] 选择SWISS-PROT蛋白质序列数据库，网址为http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html，NCBI蛋白质序列数据库，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=protein。蛋白质序列同源性分析数据库网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST；http://us.expasy.org/tools/blast/。MHC Ⅱ类分子结合位点预测：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/。选定大鼠、豚鼠和人的MBP作为比对序列。 [结果] 通过综合考虑，筛选出4种与多发性硬化发病最可能相关的病毒肽段。它们是乙型肝炎病毒多聚酶肽段，氨基酸序列为GCYGSLPQSHIIQKIKECFR；JC病毒大T抗原肽段，氨基酸序列为HICKGFQCFKKPRTPPPK；EB病毒DNA多聚酶肽段，氨基酸序列为TGGVYHFVKKHVHES；人类疱疹病毒-6[U70]碱性核酸外切酶肽段，氨基酸序列为IVERETRGQSENPLWHALRR。 二．合成病毒多肽诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（EAE）免疫学分析的体外实验 [目的] 研究4条合成病毒肽是否带有与豚鼠MBP68-86相似的抗原表位，即具有与MBP68-86相似的免疫反应性（抗原性）。[方法] 4条病毒多肽由吉尔生化（上海）有限公司合成，纯度98％，氨基酸序列由高效液相色谱仪分析和纯化，质谱仪检测确认。10只Lewis雌性大鼠，购于北京维通利华动物技术有限公司，6-8周龄，体重170-190克，随机分为两组。5只Lewis大鼠用豚鼠MBP68-86免疫，5只Lewis大鼠用牛MBP免疫。免疫后第9天处死大鼠，制备脾脏和淋巴结细胞悬液。用豚鼠MBP68-86／牛MBP和4条病毒多肽分别刺激两组大鼠的脾脏和淋巴结细胞，并设无抗原刺激为对照组（共6组）。用Griess试剂法测定各组脾脏细胞分泌一氧化氮（NO）的水平；用3H-TdR法测定各组淋巴细胞的增殖反应；用ELISA双抗体夹心法测定各组细胞因子IFN-γ的分泌量；用ELISA间接法检测MBP68-86／MBP诱导抗体和合成肽的交叉反应性。用统计软件SPSS12.0对数据进行统计分析和处理。 [结果] 1) 豚鼠MBP68-86和牛MBP都能在体外很好地刺激其对应免疫大鼠的脾细胞分泌NO。与其他组相比，JC病毒肽也能在体外刺激MBP68-86免疫大鼠的脾细胞分泌NO，72小时与对照组相比，有统计学差异（P＜0.05）。对MBP免疫大鼠脾细胞的刺激作用，各病毒肽和对照组相比，无统计学差异（P＞0.05）。2) 淋巴细胞增殖反应的结果显示，与对照组相比，JC病毒肽和豚鼠MBP68-86相似，在体外对MBP68-86免疫的大鼠淋巴结细胞有良好的刺激增殖作用，统计学检验有显著性差异（P＜0.05）。但JC病毒肽在体外对MBP免疫大鼠的淋巴结细胞无刺激作用。3) 4种病毒多肽中只有JC病毒肽可以在体外很好地刺激MBP68-86免疫大鼠的脾细胞和淋巴结细胞分泌细胞因子IFN—γ，与对照组比较有统计学的显著差异（P＜0.05）。4种病毒多肽在体外刺激MBP免疫大鼠的脾细胞和淋巴结细胞分泌IFN-γ的能力都较弱。4)MBP68-86和MBP免疫大鼠的血清抗体与EB病毒肽和乙肝病毒肽的交叉反应较强，与JC病毒肽和HHV-6病毒肽的交叉反应较弱。 [结论] 1) JC病毒肽能诱导豚鼠MBP68-86免疫大鼠的脾细胞分泌NO，淋巴细胞增殖和细胞因子IFN—γ分泌，提示JC肽可能较其他多肽具有与MBP68-86更相似的免疫反应性。2) 4条合成病毒肽与豚鼠MBP68-86诱导的抗体间交叉反应性的结果显示，JC病毒肽与豚鼠MBP68-86诱导的抗体间交叉反应性低。这提示JC病毒肽可能带有与豚鼠MBP68-86相似的T细胞表位，而不带有相似的B细胞表位。3) 考虑到JC病毒肽在氨基酸组成上与豚鼠MBP68-86不尽相同，我们推测这可能与效应T细胞识别的表位扩展和（或）相似表位氨基酸组成的复杂多样性有关。 三．合成病毒多肽诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（EAE）的行为学，免疫学和病理学分析的体内实验 [目的] 研究用与髓鞘碱性蛋白（MBP）有相似序列的四条病毒多肽免疫Lewis大鼠后能否诱导出行为学、免疫学和病理学方面表现典型的EAE模型，并探讨其可能的发生机制。 [方法] 35只Lewis雌性大鼠，购于北京维通利华动物技术有限公司，6-8周龄，体重160-180克，随机分为A、B、C、D、E、F、G七组，每组5只。A组为阴性对照组，用TB 2mg+IFA 200μl（两者混合即CFA）每只大鼠双后足垫各皮下注射100μl；B组是阳性对照组，用豚鼠MBP68-86 25μg+TB2mg+IFA200μl免疫；C组是用牛MBP 100μg+TB2mg+IFA200μl免疫；D组是用乙肝多聚酶肽段免疫，每只鼠肽段250μg+TB2mg+IFA200μl；E组是用JC病毒大T抗原肽段免疫，每只鼠肽段250μg+TB 2mg+IFA 200μl；F组是用EBV DNA多聚酶肽段免疫，每只鼠肽段250μg+TB 2mg+IFA 200μl；G组是用HHV-6 U70碱性核酸外切酶肽段免疫，每只鼠肽段250μg+TB 2mg+IFA 200μl。EAE的评分标准按国际通用标准，免疫当天及以后每天称体重，并进行评分。免疫后第15天，处死大鼠。取腰段脊髓，制成冰冻切片。制备淋巴结细胞悬液。用豚鼠MBP68-86和PBS（作为对照组）分别刺激7组的淋巴结细胞，用3H-TdR法测定各组T淋巴细胞对MBP68-86的增殖反应；用ELISA双抗体夹心法检测各组淋巴细胞自发性和MBP68-86刺激下的IFN-γ和IL-10分泌；用ELISA间接法，测定每条合成肽与豚鼠MBP68-86及牛MBP诱导抗体相互间的交叉反应性。用HE染色对A组-G组35只大鼠脊髓切片进行脊髓细胞浸润的评分；用免疫组织化学方法对浸润细胞分类；用ELISA间接法测定18例MS患者和8例NND患者脑脊液中抗4条合成病毒肽的抗体。用统计软件SPSS12.0对数据进行统计分析和处理。 [结果] 1)EAE模型诱导的情况和评分：至免疫后第13天B组有4只鼠，E组有1只鼠出现临床症状。B组3只鼠均为完全性双后肢瘫痪，评分是3分，1只鼠为尾巴肌张力完全丧失，评分是1分；E组1只鼠为尾巴肌张力完全丧失，评分是1分。到第15天，E组另有1只鼠出现可疑尾巴张力降低，评分0.5分。B组和E组大鼠平均体重也显著下降，与CFA组相比，均有统计学差异（P＜0.05）。2)T淋巴细胞的增殖反应的测定：与CFA组比较，MBP68-86在体外有意义地刺激MBP68-86免疫组和JC病毒肽免疫组大鼠的淋巴结细胞增殖，有统计学差异（P＜0.05）。3)细胞因子IFN-γ的测定：B组（豚鼠MBP68-86免疫）和E组（JC病毒肽免疫）在豚鼠MBP 68-86刺激下，释放的IFN-γ量最大，两组与CFA组比较有统计学差异（P＜0.05）。4)在有或无MBP 68-86刺激下，细胞因子IL-10的水平在各组间无显著性差异。5)MBP68-86免疫大鼠的血清与四条病毒肽之间无明显的交叉反应性。6)HE染色脊髓浸润细胞评级示A组、C组、D组、F组和G组均无明显浸润细胞增加。B组和E组发病鼠脊髓内有大量浸润细胞，而且血管周围浸润明显，血管套形成。7)免疫组织化学浸润细胞分类显示A组、C组、D组、F组和G组大鼠腰髓片均无明显T细胞和巨噬细胞浸润，小胶质细胞呈静止态无激活形，B组（MBP 68-86）和E组（JC病毒肽）发病大鼠的腰髓片显示与EAE评分相关的不同程度的T细胞和巨噬细胞浸润及小胶质细胞激活。8)在18例多发性硬化患者和8例非神经科疾病患者脑脊液中四条合成病毒肽抗体检测的结果示，两组组间和组内都无统计学差异。 [结论] 1)从动物行为学（EAE评分，体重），免疫学（T细胞增殖反应，细胞因子IFN-γ的测定），病理学（HE染色炎性细胞浸润情况，免疫组织化学炎性细胞分类）等三方面来分析，本课题用与MBP68-86有相似氨基酸序列的JC病毒肽在敏感鼠中诱导出了EAE模型，只是JC病毒肽免疫大鼠的发病率和发病严重程度均明显低于豚鼠MBP 68-86免疫的阳性对照组。提示JC病毒肽具有与豚鼠MBP68-86相似的致病原性或致脑炎性。2)抗体交叉反应性的结果提示JC病毒肽与豚鼠MBP 68-86诱导的抗体的交叉反应性并不高，与前一部分结论一致，再次提示JC病毒肽可能具有与MBP68—86相似的T细胞表位，而缺乏与MBP68—86相似的B细胞表位。3)本课题的研究结果支持病毒的分子模拟学说在MS发病中可能有一定的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 多发性硬化患者血清和脑脊液中常见病毒抗体/抗原的检测
• 对象与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 合成病毒多肽诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的研究
• 一.用生物信息学方法选择病毒多肽抗原
• 资料与方法
• 结果
• 结论
• 二.合成病毒多肽诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（EAE）免疫学分析的体外实验
• 材料与方法
• 结果
• 三.合成病毒多肽诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（EAE）的行为学,免疫学和病理学分析的体内实验
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述1
• 综述2
• 致谢