斯氏线虫抗逆性幼虫cDNA文库和差减文库的建立与基因表达分析

论文摘要

昆虫病原线虫是一类新型的生物杀虫剂,在害虫治理中具有广阔的应用前景。抗逆性幼虫是昆虫病原线虫发育过程中的一个特殊阶段,它是唯一能在自然环境中存活的虫态,其口、食道和肛门封闭,发育停止,具有较强的抵抗外界不良环境的能力。了解抗逆性幼虫的基因表达对探讨抗逆性机制以及抗逆性代谢机理具有十分重要的意义,进而为昆虫病原线虫的生产与应用奠定理论基础。本文构建了芜菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae G26品系抗逆性幼虫的cDNA文库,对部分片段进行了测序和同源性分析,并用抑制差减杂交技术构建了其抗逆性幼虫和三龄发育幼虫的差减cDNA文库。1芜菁夜蛾线虫抗逆性幼虫cDNA文库构建与基因表达分析通过提取S. feltiae G26品系抗逆性幼虫的总RNA,采用LD-PCR（Long-Distance PCR）法合成了双链cDNA,成功构建了cDNA文库,得到原始文库的库容为3.7×108cuf/ml。随机挑取118个克隆,测序获得100条序列,这些序列按照蛋白质功能分为热激蛋白（heat shock protein）,核糖体大小亚基蛋白（ribosomal protein ）、延伸因子（translation elongation factor 1-alpha）等。2芜菁夜蛾线虫正常发育三龄幼虫和抗逆性幼虫差减文库构建分别以抗逆性线虫cDNA为tester,以发育三龄幼虫的cDNA为driver,采用抑制性减法杂交构建了差减文库,共获得1628个克隆。通过反向Northern杂交,将其中38个阳性克隆送出测序,最终得到20条序列。利用BLAST在GenBank数据库中对获得的cDNA序列进行相似性比对分析,除去重复序列后,共得到10个上升表达差异基因。这些基因所编码的蛋白质中有3个功能已知序列,其中一个为半胱氨酸蛋白酶抑制剂,推测与线虫的抗逆性代谢机理有关;有7个基因在数据库中找到同源性序列,但功能尚不清楚。本研究结果可为阐明抗逆性幼虫形成与发育机制以及抗逆代谢机理等提供重要理论依据,进而为调控其形成与发育奠定基础,最终达到降低昆虫病原线虫生产成本,提高其防治效果的目的。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 英文缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 昆虫病原线虫及共生菌的分类概况
• 1.1 昆虫病原线虫的分类
• 1.2 共生菌的分类
• 2 昆虫病原线虫及其共生菌的生物学特性
• 2.1 昆虫病原线虫的生活史
• 2.2 共生菌的形态变异
• 3 昆虫病原线虫与其共生细菌的共生关系
• 3.1 共生菌的信息诱导作用
• 3.2 共生菌的营养作用
• 4 共生菌的代谢产物及致病性
• 4.1 内毒素
• 4.2 外毒素
• 4.3 其它代谢物质
• 4.4 共生菌的致病性
• 5 昆虫病原线虫的商品化生产及应用现状
• 5.1 昆虫病原线虫的商品化
• 5.2 昆虫病原线的应用现状
• 6 EST 技术及其应用
• 6.1 EST 技术
• 6.2 EST 技术在线虫方面的应用
• 7 SSH 技术
• 8 cDNA 文库的构建技术
• 9 本文的研究目的和意义
• 第二章 芜菁夜蛾斯氏线虫抗逆性幼虫cDNA 文库的构建及基因表达序列分析
• 1 实验材料
• 1.1 线虫、共生细菌的种类及品系
• 1.2 质粒与菌株
• 1.3 主要培养基
• 1.4 主要试剂和溶液
• 1.5 无RNA 酶实验用品的处理
• 1.6 主要仪器设备
• 2 技术路线
• 3 研究方法
• 3.1 抗逆性幼虫S. feltiae G26 品系的培养
• 3.1.1 线虫共生细菌的分离
• 3.1.2 线虫的繁殖与收集
• 3.1.3 线虫的培养
• 3.1.4 抗逆性幼虫S. feltiae G26 的获得
• 3.2 抗逆性幼虫总RNA 的提取
• 3.2.1 用UNIQ-10 柱RNA 抽提试剂盒提取线虫的总RNA
• 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 3.3 抗逆性幼虫cDNA 文库的构建
• 3.3.1 cDNA 第一链的合成
• 3.3.2 cDNA 第二链合成
• 3.3.3 蛋白酶K 消化
• 3.3.4 Sfi I 消化
• 3.3.5 cDNA 片段分级
• 3.3.6 连接
• 3.3.7 重组质粒导入E.coli
• 3.4 cDNA 文库插入片段的PCR 检测
• 3.5 测序与序列比较
• 4 结果与分析
• 4.1 文库构建的样品RNA 的质量检测
• 4.2 cDNA 文库的构建
• 4.2.1 双链cDNA 的合成
• 4.2.2 cDNA 的分级纯化
• 4.2.3 文库库容量的检测
• 4.3 cDNA 文库插入片段的PCR 检测
• 4.4 Blastx 分析结果
• 5 讨论
• 5.1 RNA 的质量对文库构建的影响
• 5.2 构建的cDNA 文库的质量评价
• 5.3 cDNA 文库载体的选择
• 5.4 文库中获得的EST 片段的功能分析
• 第三章 芜菁夜蛾斯氏线虫SSH 文库的构建
• 1 实验材料
• 1.1 线虫、共生细菌的种类及品系
• 1.2 质粒与菌株
• 1.3 主要培养基
• 1.4 主要试剂和溶液
• 1.5 主要仪器设备
• 2 技术路线
• 3 研究方法
• 3.1 线虫的培养
• 3.1.1 抗逆性幼虫S. feltiae G26 品系的培养
• 3.1.2 正常发育三龄幼虫S. feltiae G26 品系的培养
• 3.2 抗逆性幼虫和正常发育途径幼虫总RNA 的提取
• 3.3 SSH 文库构建
• 3.3.1 cDNA 第一条链的合成
• 3.3.2 cDNA 第二条链的合成
• 3.3.3 Rsa I 消化
• 3.3.4 接头连接
• 3.3.5 第一轮杂交
• 3.3.6 第二轮杂交
• 3.3.7 PCR 扩增
• 3.3.8 PCR 产物与pGEM-T easy 载体的连接
• 3.3.9 连接反应产物的转化
• 3.3.10 文库质量检测
• 3.4 反向 Northern 杂交
• 3.4.1 探针的制备
• 3.4.2 反向Northern 杂交
• 4 结果与分析
• 4.1 总RNA 的质量检测
• 4.2 tester 和driver 线虫双链cDNA 的合成和酶切
• 4.3 差减杂交PCR 产物分析
• 4.4 插入片段检测
• 4.5 地高辛杂交检测
• 4.6 阳性克隆测序结果
• 4.7 序列比对分析
• 5 讨论
• 5.1 SSH 技术构建的差减cDNA 文库
• 5.2 反式Northern 杂交
• 5.3 半胱氨酸蛋白酶抑制剂
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介