抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备与应用

论文摘要

牛乳中β-乳球蛋白是一种主要的过敏原，大约有60％牛乳过敏人群对β-乳球蛋白过敏。牛乳β-乳球蛋白与水牛乳β-乳球蛋白存在免疫交叉反应，对牛乳β-乳球蛋白过敏的人群也可能对水牛乳β-乳球蛋白过敏。因此，从食物过敏的角度探索水牛乳β-乳球蛋白具有一定理论价值。另外，由于水牛乳消费人群逐渐增加，为了保护过敏患者的健康，开展水牛乳的过敏研究将具有重要现实意义。本研究的主要内容包括水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化、兔抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备以及水牛乳β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立。在水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化过程中，建立了DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换结合Sephadex G-75凝胶层析分离纯化水牛乳β-乳球蛋白的方法。SDS-PAGE和IEF-PAGE鉴定结果表明，两种方法结合可以分离得到纯度＞90％的水牛乳β-乳球蛋白。在抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备过程中，建立了间接ELISA检测水牛乳β-乳球蛋白抗血清效价的检测方法及制备抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的程序。免疫2只日本大白兔分别获得了间接ELISA检测效价高达1：204800和1：102400及双向琼脂扩散检测效价均为1：16的抗血清。通过双向琼脂扩散试验证实了水牛乳β-乳球蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在免疫交叉反应。建立了检测水牛乳β-乳球蛋白的间接竞争ELISA方法，确定的工作条件如下：包被抗原浓度2.5μg／mL，抗体稀释倍数为1：60000；二抗稀释倍数为1：10000。包被条件为4℃过夜；37℃封阻1h；孵育条件为37℃，1h；加终止液5min后比色。该方法检测的范围为0.1ng／mL～100ng／mL，灵敏度为5.75ng／mL，最低检出限＜0.01 ng／mL。用建立的方法对4份样品进行了检测，测得阳光酸酸乳、阳光核桃花生乳、皇氏水牛乳、壮牛水牛乳的β-乳球蛋白含量分别为0.36g／L、0.472g／L、1.097g／L、0.717g／L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 食物过敏
• 1.2.1 食物过敏的概念
• 1.2.2 食物过敏机理
• 1.2.3 主要过敏性食物
• 1.3 牛乳过敏
• 1.3.1 牛乳中的主要过敏原
• 1.3.2 牛乳中过敏原蛋白的主要结构特征
• 1.3.3 过敏原表位与过敏原性
• 1.3.4 免疫交叉反应
• 1.4 水牛乳业发展概况
• 1.4.1 水牛乳的特点及优势
• 1.4.2 水牛乳业发展概况
• 1.5 食物过敏原的检测
• 1.5.1 食物过敏原的检测方法
• 1.5.2 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• 1.5.3 乳过敏原的检测
• 1.6 立题背景与研究内容
• 1.6.1 立题背景
• 1.6.2 研究内容
• 第2章 水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.2 设备
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 牛乳的预处理
• 2.3.2 除酪蛋白
• 2.3.3 超滤
• 2.3.4 分离水牛乳β-乳球蛋白
• 2.3.5 检测所分离蛋白的纯度
• 2.3.6 蛋白质含量的测定
• 2.4 结果
• 2.4.1 乳清电泳图
• 2.4.2 离子交换分离水牛乳β-乳球蛋白的结果
• 2.4.3 凝胶层析分离水牛乳β-乳球蛋白的结果
• 2.4.4 蛋白分离过程中样品蛋白含量的变化
• 2.4.5 离子交换层析及凝胶层析分离水牛乳β-乳球蛋白的得率
• 2.5 讨论
• 2.5.1 关于酪蛋白的剔除
• 2.5.2 超滤
• 2.5.3 关于离子交换层析分离水牛乳β-乳球蛋白
• 2.5.4 关于凝胶层析进一步分离纯化水牛乳β-乳球蛋白
• 2.5.5 关于SDS-PAGE、IEF-PAGE检测蛋白的纯度
• 2.5.6 分离过程中蛋白含量的变化
• 2.6 本章小节
• 第3章 抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备
• 3.1 引言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器与耗材
• 3.2.3 溶液配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 试验动物
• 3.3.2 抗原的准备
• 3.3.3 免疫方案
• 3.3.4 血清的分离
• 3.3.5 建立检测抗体效价的间接ELISA方法
• 3.3.6 间接ELISA测抗体效价
• 3.3.7 琼脂双向免疫扩散法测抗体效价
• 3.3.8 琼脂双向免疫扩散法检测抗体特异性
• 3.3.9 间接竞争ELISA法检测抗体特异性
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 抗血清效价间接ELISA检测方法的建立
• 3.4.3 琼脂双向免疫扩散法测抗体效价
• 3.4.4 琼脂双向免疫扩散检测抗体特异性
• 3.5 讨论
• 3.5.1 多克隆抗体的制备
• 3.5.2 抗体效价的检测方法
• 3.5.3 兔对水牛乳β-乳球蛋白的免疫应答
• 3.5.4 抗体特异性
• 3.6 本章小结
• 第4章 水牛乳β-乳球蛋白的间接竞争ELISA检测方法的建立
• 4.1 引言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 仪器与耗材
• 4.2.3 溶液的配制
• 4.3 方法
• 4.3.1 ELISA基本操作程序
• 4.3.2 间接ELISA法评价酶标板的质量
• 4.3.3 间接ELISA法确定抗原的最佳包被浓度和抗体的稀释倍数
• 4.3.4 抗原最佳包被条件的确定
• 4.3.5 抗原抗体最佳反应条件的确定
• 4.3.6 最佳封阻条件的确定
• 4.3.7 终止时间确定
• 4.3.8 间接竞争ELISA法比较不同抗体稀释度对竞争抑制曲线的影响
• 4.3.9 间接竞争ELISA法比较不同二抗浓度对竞争抑制曲线的影响
• 4.3.10 间接竞争ELISA标准竞争抑制曲线的制作
• 4.3.11 精确度
• 4.3.12 灵敏度与最低检出限
• 4.3.13 样品检测
• 4.4 结果
• 4.4.1 酶标板质量的评价
• 4.4.2 抗原包被浓度和抗体最佳稀释倍数的确定
• 4.4.3 抗原最佳包被条件
• 4.4.4 封阻条件的确定
• 4.4.5 抗原抗体反应条件的确定
• 4.4.6 终止时间的确定
• 4.4.7 不同抗体浓度对间接竞争ELISA竞争抑制曲线的影响
• 4.4.8 比较不同二抗稀释度对间接竞争ELISA竞争抑制曲线的影响
• 4.4.9 制作间接竞争ELISA标准曲线
• 4.4.10 竞争抑制率批间、批内差异
• 4.4.11 灵敏度与最低检出限
• 4.4.12 样品检测结果
• 4.5 讨论
• 4.5.1 酶标板质量的评价
• 4.5.2 包被
• 4.5.3 封阻
• 4.5.4 抗原抗体反应条件
• 4.5.5 抗体稀释度对竞争抑制曲线的影响
• 4.5.6 酶标二抗稀释倍数对竞争抑制曲线的影响
• 4.5.7 方法的应用与比较
• 4.6 本章小结
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 硕士期间成果