论文摘要
目的：通过靶向p38α的siRNA干扰人血管内皮细胞的p38a信号通路,探索其对血管内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因启动子转录活性的调节作用。方法：建立双荧光报告基因系统,以pRL-TK作为内参照,将构建好的pGL2-eNOS质粒与siRNA-p38a共转染HUVEC-12细胞,然后检测各组细胞eNOS基因启动子转录活性；利用Western blot检测siRNA-p38a干扰HUVEC-12细胞后磷酸化p38α蛋白的表达；QIAGEN RNeasy Mini Kit法提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术检测siRNA-p38a干扰后eNOS mRNA的表达：用Western blot检测siRNA-p38a干扰HUVEC-12细胞后非磷酸化eNOS蛋白和磷酸化eNOS蛋白的表达；籍原位免疫荧光技术检测siRNA沉默p38a后eNOS蛋白在内皮细胞内的表达和分布；最后通过硝酸盐还原酶法检测siRNA干扰后内皮细胞培养上清液中NO的含量,进一步证实siRNA干扰p38α信号通路对eNOS基因表达及其功能的影响。结果：转染siRNA的内皮细胞其eNOS基因启动子的转录活性上升,而LPS刺激p38α信号通路后内皮细胞eNOS基因启动子的活性下降；与对照组比较,siRNA-p38a干扰后内皮细胞的磷酸化p38a蛋白表达明显减弱,而相应的eNOS启动子转录活性升高,伴随eNOSmRNA水平上调和磷酸化eNOS蛋白的表达量明显升高,而非磷酸化eNOS蛋白水平变化却不明显,随之内皮细胞培养上清中NO的含量也增高；siRNA-p38α干扰后内皮细胞内eNOS蛋白原位表达的荧光强度似高于对照组,分布主要见于细胞膜。相反,p38a信号刺激剂LPS或TNF-a处理内皮细胞则导致与siRNA-p38α干扰相反的结果。结论：siRNA干扰p38a信号通路可上调人血管内皮细胞eNOS基因的转录活性,导致NO的生成增多。
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标签：内皮型一氧化氮合酶论文; 一氧化氮论文; 内皮细胞论文;