鱼类疫苗的研究：Ⅰ：海水鱼类病原菌乳化口服疫苗的研究；Ⅱ：迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌外膜蛋白疫苗的研究

论文摘要

本论文的目的是研究几种病原菌口服疫苗接种鱼类的免疫效果,并从常见病原菌株中筛选几个具有较好保护效果的蛋白抗原,利用口服免疫的方式,接种养殖动物,并检测免疫效果。以10号白油为有机溶剂,采用搅拌与均浆方法制备鳗弧菌M3和SMP1的油乳化二价疫苗,用饵料包埋后以口服途径免疫养殖大菱鲆,评价免疫大菱鲆的免疫应答和疫苗的保护效果。结果显示,以油乳化和未油乳化疫苗分别连续口服免疫大菱鲆一周后,在后肠组织,乳化疫苗刺激产生的非特异性活力、特异性抗体水平均高于未乳化疫苗;而在血清,两种疫苗引起的两种酶的活力、SMP1抗体水平没有变化,但在乳化疫苗免疫的大菱鲆检测到明显高于未免疫对照大菱鲆的M3抗体水平。大菱鲆后肠组织原位杂交结果显示,口服免疫的大菱鲆后肠褶皱有IgM抗体的产生和分布。其中,乳化疫苗免疫大菱鲆的IgM抗体的产生和分布水平高于未乳化疫苗免疫的大菱鲆。攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的大菱鲆对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%,表明乳化疫苗比未乳化疫苗更有效地保护大菱鲆、抵抗病原的感染。在乳化疫苗免疫持续期的研究中,免疫的大菱鲆后肠在免疫后120天仍能检测到抗体效价,在免疫后90天还能观察到一定的免疫保护效果。免疫30天、60天、90天和120天的大菱鲆分别获得100%、66.7%、36.7%和13.3%的免疫保护力。以鳗弧菌M3和SMP1、链球菌CF、迟缓爱德华菌SMW7作为细菌抗原制备油乳化多价口服疫苗和轮虫携带疫苗,口服途径免疫养殖大菱鲆与大菱鲆初孵仔鱼。结果显示,在免疫大菱鲆后肠可检测到抗M3抗体水平的提高(P<0.05),而在其胆汁、鳃、中肠、体表黏液、前肠与血清中抗体效价变化与对照组没有显示出差异;没有检测到免疫大菱鲆后肠抗SMP1、SMW7、CF抗体效价。M3浸泡攻毒实验显示,口服免疫的大菱鲆获得了100%的免疫保护力;在M3注射攻毒和SMP1、CF、SMW7浸泡攻毒大菱鲆的实验中,在每个攻毒组中,免疫组大菱鲆开始死亡的时间都要比对照组有不同程度的延迟,但攻毒大菱鲆都发生死亡,不能显示出与对照组的差异。轮虫携带免疫的结果显示,免疫的大菱鲆初孵仔鱼并未获得较好的保护效果,与对照大菱鲆没有体现出差异。从致病性病嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)LSA34克隆并表达ahaI基因和gapA基因,从迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)LSE40克隆并表达eseB,将所得蛋白分别通过腹腔注射途径免疫大菱鲆,检测蛋白的免疫原性和免疫保护。结果在免疫后7天就可以检测到AhaI、GapA蛋白免疫组大菱鲆产生的抗体,至第40天可以检测到明显的保护性抗体,之后抗体效价增加明显,直至第60天时达到最高值。EseB免疫的大菱鲆第一次免疫后15天就有较高的抗体效价产生,明显高于对照组大菱鲆血清抗体效价,到距第一次免疫60天时,抗体效价达到最高值。攻毒实验显示,与对照组相比,AhaI免疫组和GapA免疫组对LSA34感染的免疫保护力分别为80%和100%;AhaI免疫组和GapA免疫组对LSE40感染的免疫保护力分别为30%和10%。,而对照组牙鲆对人工攻毒不具有保护力。以AhaI和GapA作为疫苗免疫大菱鲆,使大菱鲆获得了对嗜水气单胞菌LSA34较高的免疫保护;而对迟缓爱德华氏菌LSE40的交叉保护能力没有明显提高。EseB免疫的大菱鲆在攻毒实验中并没有显示出较好的保护效果,与对照组相比,只是在死亡时间上有所延迟。以从致病性嗜水气单胞菌中克隆的ahaI和gapA基因表达出的蛋白为蛋白抗原制备油乳化疫苗,用饵料包埋后以口服途径免疫养殖牙鲆,评价免疫牙鲆的免疫应答和疫苗的保护效果。结果显示,以油乳化和未油乳化疫苗分别免疫牙鲆一周后,在后肠组织,AhaI和GapA乳化疫苗免疫组牙鲆检测到抗体,且分别高于AhaI和GapA未乳化疫苗免疫的牙鲆;而在血清,GapA的两种疫苗引起的GapA抗体水平没有变化;但在AhaI乳化疫苗免疫的牙鲆第21天和第35天的血清中检测到高于未免疫对照牙鲆的AhaI抗体水平,AhaI未乳化疫苗免疫牙鲆血清对照组相比没有检测到AhaI抗体水平的变化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一章 综述
• 第一节 鱼类的免疫系统和免疫机制
• 1.1.1 鱼类的免疫器官和组织
• 1.1.2 鱼类的免疫细胞
• 1.1.3 体液免疫及其免疫因子
• 1.1.4 细胞免疫及其免疫因子
• 第二节 鱼用疫苗的研究进展
• 1.2.1 疫苗发展简史
• 1.2.2 鱼用疫苗
• 1.2.3 鱼用疫苗接种方法
• 第三节 水产养殖动物病原菌的主要保护性抗原研究进展
• 1.3.1 荚膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）
• 1.3.2 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）
• 1.3.3 外膜蛋白（Outer membrane protein, OMP）
• 第二章 几种致病菌口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究
• 第一节 鳗弧菌油乳化疫苗制备及乳剂特性的研究
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果
• 2.1.3 讨论
• 第二节 几种病原菌多联油乳化疫苗口服免疫大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 结果
• 2.2.3 讨论
• 第三节 鳗弧菌油乳化二价疫苗口服免疫大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 结果
• 2.3.3 讨论
• 第四节 鳗弧菌油乳化疫苗对大菱鲆口服免疫效果延续期的研究
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.2 结果
• 2.4.3 讨论
• 第五节 几种致病菌轮虫携带口服疫苗对大菱鲆初孵仔鱼免疫效果的研究
• 2.5.1 材料与方法
• 2.5.2 结果
• 2.5.3 讨论
• 第三章 嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌外膜蛋白的表达纯化与免疫原性研究
• 第一节 迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌蛋白抗原基因的克隆与表达
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.2 结果
• 3.1.3 讨论
• 第二节 迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌蛋白抗原注射免疫大菱鲆的研究
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果
• 3.2.3 讨论
• 3.2.4 小结
• 第四章 嗜水气单胞菌外膜蛋白AhaI 和 GapA34 口服免疫养殖牙鲆的效果研究
• 第一节 材料与方法
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 实验用鱼
• 4.1.3 蛋白表达及纯化
• 4.1.4 油乳化疫苗的制备
• 4.1.5 蛋白乳化疫苗口服免疫牙鲆
• 4.1.6 免疫反应的测定
• 4.1.7 攻毒实验
• 4.1.8 统计学分析
• 第二节 结果
• 4.2.1 后肠免疫应答
• 4.2.2 血清的免疫应答
• 4.2.3 LSA34 浸泡攻毒牙鲆结果
• 第三节 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 发表文章及申请专利情况
• 附录1 各种培养基和溶液
• 附录2 各种试剂及实验仪器
• 致谢