鼻咽癌患者血清标志物的初步筛选、鉴定及功能研究

论文摘要

目的:鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方和东南亚地区最为常见的恶性肿瘤之一。由于其发病部位较隐蔽及早期症状不明显,就诊时多为晚期,导致不少患者延误了治疗。因此,筛选出鼻咽癌早期诊断的相关血清学标志物尤为迫切。本研究应用蛋白质芯片及表面加强激光解吸/电离飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra,SELDI-TOF-MS）技术,筛选鼻咽癌患者血清蛋白质,并对差异蛋白进行鉴定。另外,对所鉴定的淀粉样蛋白A（Serum amyloid protein A,SAA）与鼻咽癌的关系进行了初步研究。方法:收集了113例鼻咽癌患者、67例鼻咽部良性疾病患者和82例正常对照血清标本,-80℃保存备用。采用弱阳离子交换蛋白质芯片（CM10蛋白芯片）进行蛋白质检测,然后用Biomarker Wizard?3.2软件对结果进行分析（定义信噪比为5,激光能量为220,检测器敏感度为9,最佳检测分子量范围为3000-50000D）。同时,应用Tricine-SDS-PAGE胶分离和质谱鉴定,对所检测到的差异蛋白峰进行蛋白质鉴定,并采用Western-blotting进一步验证该蛋白质在鼻咽癌患者、鼻咽部良性疾病患者和正常对照血清中的表达。应用RT-PCR和Western-blotting检测SAA蛋白质在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE1以及正常鼻咽上皮细胞（原代）中的表达。网上查阅SAA基因的全长cDNA序列,依据该序列设计3个特异干扰片段,插入pSIREN-Shuttle（Clontech公司）RNA干扰表达??体,构建针对SAA基因的干扰表达载体,以空载体为阴性对照,转染CNE2细胞,运用RT-PCR和Western-blotting方法,分析SAA基因表达,建立SAA基因表达明显降低的CNE2细胞系。采用MTT法、流式细胞术及平板集落形成实验,检测SAA基因表达降低对CNE2细胞生长、增殖及集落形成的影响。结果:（1）在102例鼻咽癌患者血清中出现一个峰值（阳性率为90.27%）,明显高于鼻咽部良性疾病患者和正常对照的蛋白峰（t=6.34;P<0.05）,大小约为11.72km/z。经Tricine-SDS-PAGE胶分离和质谱鉴定分析,11.72k m/z蛋白峰为血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid protein A,SAA）。（2）RT-PCR和Western-blotting检测结果显示,SAA蛋白质在鼻咽癌患者血清中呈较高水平表达,而在鼻咽部良性患者和正常对照的血清中低表达或不表达。SAA蛋白质在两株鼻咽癌细胞CNE2及HNE1中的表达均较高,而在正常鼻咽上皮细胞（原代）中则低表达或不表达。（3）成功构建的pSS-SAA siRNA表达载体,能有效干扰SAA基因在CNE2细胞的表达,SAA基因在CNE2细胞中的表达降低,其生长增殖速度减慢及细胞集落形成能力均降低（t=5.26 ;P<0.05）。结论:（1）成功筛选和鉴定出鼻咽癌血清候选标志物SAA。（2）成功建立了能有效干扰SAA基因表达的CNE2细胞系。（3）鼻咽癌患者血清中存在SAA蛋白质的高表达,SAA基因的高表达可能与鼻咽癌的发生发展密切相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写注解
• 技术路线
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果