姜黄素对大鼠肾系膜细胞增殖和致纤维化影响的实验研究

论文摘要

早期肾系膜细胞的增殖以及随后的纤维化，是增殖性肾小球肾炎的显著特征；它也将最终导致终末期肾病。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳类雷帕霉素靶蛋白（PI3K／Akt／mTOR）信号途径现被公认是细胞生命活动的重要通路，它调控着细胞的生与死。细胞因子、高糖、机械应力等刺激因素均能通过此信号途径，诱导系膜细胞活化和增殖。姜黄素是从植物姜黄根茎中提取的主要活性成分，具有广泛的生物学效应，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化等。然而，姜黄素在肾脏病和纤维化领域的研究尚不太多。有报道姜黄素减轻阿霉素造成的肾损伤，也有体外肾成纤维细胞研究发现姜黄素能抑制转化生长因子β所致的纤维化。本实验探讨姜黄素对大鼠肾系膜细胞增殖和致纤维化的影响以及可能与磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳类雷帕霉素靶蛋白信号通路的关系。采用四甲基偶氮唑蓝法检测药物对系膜细胞增殖的影响。姜黄素呈浓度依赖的方式抑制血清刺激系膜细胞的增殖，6.25μM即可显现19.5％的细胞生长抑制率，其后浓度越高，抑制效应越强，在100μM时达到89.7％；其半数生长抑制率约为24.92μM。磷脂酰肌醇3激酶特异抑制剂LY294002也呈浓度依赖方式抑制系膜细胞的增殖，50μM抑制约60％系膜细胞生长。哺乳类雷帕霉素靶蛋白抑制剂雷帕霉素亦随浓度增加，抑制细胞增殖效应增强；1nM雷帕霉素抑制效果达到26.7％，而100nM雷帕霉素抑制效果亦只增加到46.3％；其半数生长抑制率为381.14nM。姜黄素联合雷帕霉素对系膜细胞增殖的抑制效果较同浓度单用组强，其协同治疗指数小于1，二者起协同作用。分别用LY294002和雷帕霉素预孵育系膜细胞30min，姜黄素对系膜细胞增殖的抑制作用较未预孵育减弱；提示姜黄素的抑制效应是依赖PI3K／Akt／mTOR信号途径的。流式细胞周期分析显示姜黄素和雷帕霉素均以浓度依赖的方式阻滞系膜细胞周期于G0／G1期，中等剂量联合应用可得到较单用一种药物更强的阻滞效应。细胞同步生长后，用10％血清刺激系膜细胞，在0～120分钟内磷酸化Akt的表达呈现动态变化，15分钟即可出现明显表达，30分钟时达到最强，此后逐渐减弱，而总Akt的表达未受到明显影响。使用PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂雷帕霉素预孵育系膜细胞后，p-Akt表达较阳性对照组减弱，尤其是LY294002，这提示血清刺激的系膜细胞生长是通过PI3K／Akt／mTOR信号途径的。姜黄素对血清刺激后p-Akt的表达呈浓度依赖性抑制；而LY预孵育细胞后，其抑制作用较未预孵育减弱，提示姜黄素的抑制作用部分通过PI3K／Akt信号途径。姜黄素对血清刺激后系膜细胞CTGF和Fn mRNA的表达也起抑制作用，浓度越高其抑制作用越强。LY294002预孵育细胞后，可减弱姜黄素对CTGF和Fn mRNA表达的抑制；而雷帕霉素联合姜黄素持续作用，却可增强姜黄素对CTGF和Fn mRNA表达的抑制。姜黄素亦抑制血清刺激后系膜细胞CTGF蛋白的表达，呈浓度依赖性，LY294002的预孵育细胞可削弱其抑制CTGF蛋白表达的作用，但联合应用雷帕霉素可增强其抑制CTGF蛋白的作用。使用ELISA方法检测姜黄素对系膜细胞上清液中分泌的Fn蛋白，也可得到与CTGF蛋白表达一致的结果。上述结果表明，姜黄素以浓度依赖的方式抑制大鼠肾小球系膜细胞的增殖和致纤维化因子CTGF、细胞外基质Fn的表达；其作用的机制可能与抑制PI3K／Akt／mTOR信号途径相关。因此，姜黄素是一个潜在的抗肾纤维化的药物。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 姜黄素对大鼠肾系膜细胞增殖的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 姜黄素对大鼠肾系膜细胞致纤维化影响的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述 姜黄素的研究进展
• 致谢