论文摘要
背景：胰腺癌恶性程度极高,是消化系统第二大恶性肿瘤,在肿瘤死亡原性诱因中列第四位,是5年生存率最低的恶性肿瘤,而缺乏早期诊断手段和化疗耐药是导致胰腺癌高死亡率的主要原因。胰腺癌早期诊断率低,导致95%以上的胰腺癌患者在明确诊断时肿瘤已进入进展期,手术虽是根治胰腺癌的唯一方法,但根治性手术切除率仅15-20%；化疗是胰腺癌主要的辅助治疗手段,然而,肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性严重地影响了疗效。因此,提高早期胰腺癌的诊断率、扭转胰腺癌耐药,是提高胰腺癌的治疗效果和改善预后的关键。近年来,人们在研究中发现,microRNAs （miRNAs）是稳定存在于外周血中一种候选的肿瘤标志物,同时与肿瘤耐药密切相关。miRNAs是近年来发现的一系列内源性单链非编码的小RNAs分子,长度约22个核苷酸。其广泛分布于真核生物中。miRNAs常以基对相互原则与靶信使RNA （mRNA）的3’端的非翻译区完全或不完全配对,降解靶信使RNA或阻遏其转录后翻译。对组织分化、细胞分化、凋亡等正常的生理过程起到重要的调控作用。最近多项研究发现,若干miRNAs在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调,这一现象初步揭示了肿瘤发生、进展、耐药与miRNAs表达量及种类之间存在相关性,为逆转现状,从根本上改善肿瘤预后提供新的途径。目的：在胰腺癌中,寻找具有潜在诊断价值的外周血特异性miRNAs,探索胰腺癌耐药相关的miRNAs,并通过调控miR-155在胰腺癌早期抑制]hMLH1表达改善胰腺癌预后。探索miRNAs对于胰腺癌早期诊断、治疗和指导预后的价值。方法：1、人胰腺癌组织和外周血特异性miRNAs表达谱的建立：①建立利用实时定量PCR（Real-time PCR）对临床血浆标本中循环miRNAs进行定量测定的技术平台；②采用基于qPCR（quantitative PCR）的TaqMan低密度阵列（TaqMan low density array, TLDA）技术,对健康个体、胰腺癌和胰腺炎患者血浆标本中的循环miRNAs进行初步分析,建立人胰腺癌、胰腺炎外周血特异性miRNAs表达谱；③在筛选结果中,选择5种在胰腺癌中呈差异表达的miRNAs进行验证（let-7b、miR-miR-363、miR-942、miR-645、miR-190b）。2、耐药相关miRNAs筛选：①cck-8法验证胰腺癌耐药（耐健泽、耐5-fu、耐阿霉素）细胞株的耐药性；②利用miRNAs芯片技术比较人胰腺癌耐药（耐健泽、耐5-fu、耐阿霉素）细胞株与非耐药细胞株的miRNA表达差异；③根据表达谱结果,应用real-time PCR对部分差异表达的miRNA进行验证。3、探索与胰腺癌早期事件相关的miR-155的作用机制及其指导治疗、改善预后的意义：①应用双荧光素酶报告基因及Western Blot的方法探索miR-155下游潜在靶基因hMLH1;②应用免疫组化方法研究其与胰腺癌临床预后的关系。结果：1、①建立了循环miRNAs定量检测方法；②在胰腺癌、胰腺炎、正常人的血浆中共检测到188种miRNAs。胰腺癌与胰腺炎相比,有6条显著上调、1条显著下调（P<0.01）；胰腺癌和胰腺炎相比,有10条显著上调,9条显著下调（P<0.01）；③验证结果显示,miR-942在胰腺癌与健康人外周血中表达呈显著差异（P=0.023）。2、①SW1990的阿霉素、氟尿嘧啶和吉西他滨的耐药株的耐药性分别是亲本株的12.57、133.68和438.96倍；②与亲本株相比,在SW1990/Gem细胞株中差异表达显著的miRNAs有58条,在SW1990/Adm细胞株中有59条,在SW1990/5-Fu细胞株中有47条。在SW1990/Gem、5-Fu两个耐药株中同时呈现显著差异的miRNAs14条,在SW1990/Gem、Adm两个耐药株中同时呈现显著差异的miRNAs22条,在SW1990/5-Fu、Adm两个耐药株中同时呈现显著差异的miRNAs 12条；其中3个耐药株中同时呈现显著差异的miRNAs7条;即miR-33a、33b、1285、486-5p、99b*、125a-3p、200c*在吉西他滨、氟尿嘧啶、阿霉素3株耐药株中的表达与亲本株相比差异具有显著性（P<0.05）；③文献检索胰腺癌耐药相关基因,及在其它肿瘤中调控上述基因的miRNAs,并与本研究的筛选结果进行比对。其中miR-34a、424、449a、497、451、21和miR-101在胰腺癌耐药株中呈差异表达；④应用实时荧光定量（Real Time-PCR）的方法对miR-486-5p、miR-125a-3p、miR-99b*、miR-1285进行验证,结果与芯片的结果一致,且均存在显著差异（P<0.05）3、①hMLH1是miR-155的靶基因；②miR-155通过与hMLH1的3’-UTR区不完全配对,抑制mRNA翻译；③hMLH1与胰腺癌的恶性进展及预后相关。结论：1、建立成熟的循环miRNAs定量检测方法；初步建立胰腺癌miRNAs表达谱；has-mir-942可能成为胰腺癌血清特异性肿瘤标记物,具有潜在的早期诊断价值。2、初步建立胰腺癌耐药相关miRNAs表达谱,其中miR-486-5p、miR-99b*、miR-125a-3p、miR-1285是潜在的与胰腺癌多药耐药相关的上游调控基因,验证其差异表达可能成为对耐药人群早期诊断的依据,进而通过指导个体化治疗改善预后；明确与其他肿瘤耐药相关的miRNAs （miR-34a、424、449a、497、451、21和miR-101）亦在胰腺癌miRNAs耐药谱中呈现差异表达,为进一步验证其在胰腺癌耐药机制中的作用提供线索。3、MiR-155通过下调靶基因hMLH1调控胰腺癌的恶性进展。