植物交替氧化酶（AOX）大肠杆菌超量表达及从斑叶阿若母（Arum maculatum）分离纯化天然AOX

论文摘要

交替氧化酶（Alterative oxidase, AOX）是广泛存在于植物、藻类、真菌和原生生物线粒体内膜的交替呼吸途径终端氧化酶,从主呼吸链的辅酶Q分岔,氧化辅酶Q、还原氧分子生成水。交替氧化酶氧化过程没有质子穿膜运动、不产生膜电子势差,没有ATP产生,能量以放热方式散发。交替氧化酶是双铁羧酸蛋白质家族的膜蛋白质,至今只有其二级结构的几种假设模式,最新的模式认为交替氧化酶是膜界面蛋白质,不是跨膜蛋白。交替氧化酶的3级结构还不清楚,原因是交替氧化酶分离后不稳定,很难获得有活性的纯化的蛋白质供其蛋白质晶体学结构分析。因此,目前对交替氧化酶的研究主要集中在分离与纯化的探索。本文的目的是通过大肠杆菌超量表达和从植物提取天然交替氧化酶二个途径探索交替氧化酶的分离和纯化,为其结构和功能的研究打下基础。产热植物枯苞（Sauromattum guttatum）的交替氧化酶基因（AOX）被克隆到分泌表达载体pFLAG-1,携带AOX基因的重组质粒pFLAG-1-AOX转化宿主细胞大肠杆菌DH5α。DH5α在不同温度下培养至不同的细胞密度加入不同浓度诱导物异丙基硫代—β—D—半乳糖苷（IPTG）,IPTG诱导AOX基因优化表达。实验表明AOX优化表达条件为:温度37℃,细胞密度OD600=0.6,诱导物IPTG浓度0.2mmol/L。离心分离细胞外培养基蛋白质和细胞蛋白质;渗透压方法破碎宿主细胞,分离可溶的细胞外周质蛋白;提取细胞沉淀物中可溶蛋白质。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白质,AOX免疫印迹特异识别亚细胞AOX。亲和层析纯化可溶的外周质AOX融合蛋白。结果显示:优化表达产生少量、分泌到细胞外周质、可溶的AOX融合蛋白和大量不溶的AOX融合蛋白。表达的枯苞（S. guttatum）交替氧化酶为二种形态:相对分子量约为32kDa的还原态单体和分子量约为64kDa的氧化态二聚体。分离斑叶阿若母（Arum maculatum）花序组织线粒体,线粒体保持完整,蛋白质浓度为14.0mg/ml,线粒体AOX呼吸活性为平均耗氧32μmoles/min。用非离子去污剂0.5% dBC把AOX从线粒体膜上溶解下来,AOX酶活性可以恢复70-100%;DEAE交联琼脂糖（ DEAE-Sepharose）阴离子交换层析纯化AOX。改进了线粒体分离和AOX溶解纯化方法,即用5mmol/L还原剂二硫苏糖醇（DTT）保持交替氧化酶还原活性态,10mmol/L丙酮酸激活交替氧化酶活性。结果表明,

论文目录

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• 第一章 前言
• 1 植物交替氧化酶
• 2 植物交替氧化酶的结构
• 3 植物交替氧化酶的活性
• 4 植物交替氧化酶的调控
• 5 植物交替氧化酶的生理功能
• 6 大肠杆菌表达交替氧化酶
• 7 分离植物天然交替氧化酶
• 8 目的
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 交替氧化酶重组基因转化大肠杆菌
• 2.3 交替氧化酶融合蛋白表达
• 2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5 交替氧化酶免疫印迹
• 2.6 交替氧化酶亚细胞定位
• 2.7 交替氧化酶亲和层析
• 2.8 三氯醋酸法沉淀交替氧化酶
• 2.9 双向电泳分离交替氧化酶
• 2.10 分离斑叶阿若母（Arum maculatum）线粒体
• 2.11 溶解线粒体膜交替氧化酶
• 2.12 氧电极测定交替氧化酶活性
• 2.13 快速蛋白液相层析（FPLC）
• 2.14 丙酮酸对室温下AOX活性影响
• 2.15 蛋白酶抑制剂（E64, Leupeptin, Pepstatin）对AOX 活性影响
• 2.16 蛋白质银染显色
• 第三章 结果与分析
• 1 交替氧化酶融合蛋白在大肠杆菌中优化表达
• 1.1 大肠杆菌pFLAG-1-AOX 表达原理
• 1.2 重组质粒转化大肠杆菌
• 1.3 交替氧化酶融合蛋白表达
• 1.4 温度对交替氧化酶表达的影响
• 1.5 宿主细胞性质对交替氧化酶表达的影响
• 1.6 交替氧化酶融合蛋白优化表达
• 1.7 交替氧化酶融合蛋白渗漏表达
• 1.8 交替氧化酶免疫印迹第一抗体及第二抗体浓度筛选
• 2 AOX 融合蛋白宿主细胞亚细胞定位
• 2.1 优化表达的交替氧化酶宿主细胞亚细胞定位
• 2.2 不同温度18℃、25℃、30℃、37℃表达的交替氧化酶亚细胞定位
• 2.3 不同细胞密度表达的交替氧化酶宿主细胞亚细胞定位
• 3 纯化宿主细胞外周质交替氧化酶
• 3.1 纯化阳性对照细胞外周质细菌碱性磷酸酶（BAP）
• 3.2 纯化细胞外周质交替氧化酶
• 4 从海芋植物斑叶阿若母（Arum maculatum）花序组织线粒体分离纯化交替氧化酶
• 4.1 分离线粒体膜交替氧化酶
• 4.2 蛋白水解酶抑制剂对离体线粒体交替氧化酶活性影响
• 4.3 丙酮酸对稳定纯化的交替氧化酶活性的作用
• 4.4 纯化交替氧化酶
• 4.5 双向电泳分离交替氧化酶
• 第四章 讨论
• 1 pFLAG-1-AOX 大肠杆菌优化表达 AOX
• 2 从宿主细胞大肠杆菌分离纯化交替氧化酶
• 3 从海芋植物线粒体分离纯化天然的交替氧化酶
• 4 总结
• 参考文献
• 致谢
• 发表的主要学术论文目录