论文摘要
背景:急性缺血性卒中因具有发病率高、致残率高、病死率高及神经功能损伤的难治性等特点,倍受国内外学者关注。溶栓治疗是目前唯一被循证医学证实的治疗急性脑梗死的有效方法,但是容易引起出血转化等多种严重并发症,且有严格的时间窗限制,这些大大限制了其临床应用。经现代研究证实,血脑屏障通透性的增高和完整性的破坏是溶栓后出血转化的重要原因。紧密连接是保持血脑屏障完整性的重要因素,由跨膜蛋白和膜相关蛋白共同组成,其功能是将相邻两个细胞连接起来,封闭了细胞间的空隙,阻挡细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内并参与细胞生长分化的信号的传递等。分子生物学等研究证实,紧密连接是血脑屏障通透性调节的中心环节,Z0-1及Occludin是TJ的主要结构蛋白,其表达水平的变化与脑微血管通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。黄芪与川芎是临床常配伍运用的益气活血药对,通过前期研究我们发现芎芪有效成分能够改善MCAO大鼠缺血侧脑组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量,使白细胞黏附程度明显减轻,现代研究证明它们都能对血脑屏障产生显著的保护作用,但在对紧密连接的作用方面尚未见报道。本研究首先探讨了急性脑梗死大鼠溶栓后不同时点血脑屏障通透性的改变以及川芎嗪、黄芪注射液对血脑屏障通透性的影响,然后应用形态学、分子生物学等方法,证明川芎嗪、黄芪注射液对血脑屏障的保护作用的机制,为今后利用中药复方的多组分特点及采用中西医结合疗法来提高溶栓成功率、预防出血转化、扩大溶栓适用范围等方面的研究奠定基础。方法;1.溶栓用大鼠急性大脑中动脉栓塞模型的建立将大鼠麻醉,仰卧固定。取颈正中皮肤切口,钝性分离肌肉及皮下组织,暴露右侧颈总动脉,分离迷走神经,将颈总动脉钝性分离至暴露颈外动脉和颈内动脉分叉处。用注射器选大鼠易结扎止血的动脉处取动脉血0.1ml,吸入4U凝血酶,混匀静置10分钟,待血液凝固后将其注入24G静脉留置针管,制成长约1cm的栓子,后接1～2ml的生理盐水注射器。制作过程中注意勿使留置针管内进入空气。将留置针在颈外动脉和颈内动脉分叉的前方穿刺进颈总动脉,并向前内侧进入颈内动脉内10mm,拔出针芯,用吸有生理盐水的注射器快速将栓子冲入颈内动脉内,结扎颈总动脉并缝合肌肉及皮肤。2.实验大鼠给药及分组实验一:将大鼠随机分为假手术组、溶栓组、川芎组、黄芪组及联合治疗组。其中溶栓组、川芎组、黄芪组及联合治疗组又按不同处死时间点（溶栓后3、6、24小时）平均分组。除假手术组外各组均于造模3h后经股静脉给予rt-PA,假手术组给予等体积生理盐水。川芎组大鼠在造模后和溶栓后均立即腹腔注射川芎嗪注射液;黄芪组大鼠在造模后和溶栓后均立即腹腔注射黄芪注射液;联合组大鼠在造模后和溶栓后均立即腹腔注射川芎嗪注射液+黄芪注射液。实验二:将大鼠随机分为假手术组、溶栓组、治疗组、H7组、治疗加H7组。除假手术组外各组均于造模3h后经股静脉给予rt-PA。假手术组给予等体积生理盐水。治疗组分别于造模前及溶栓后立刻予以腹腔注射,川芎嗪注射液+黄芪注射液,H7组在溶栓前30分钟给予H7腹腔注射,假手术组予同样体积的生理盐水。3.利用伊文思兰的渗透性评估血脑屏障的通透性,透射电镜观察血脑屏障通透性的变化。4.荧光免疫组化法测定缺血区脑组织血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin蛋白表达及分布。5.Western Blot法检测缺血区脑组织血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的蛋白量。6.采用RT-PCR、荧光免疫组化法、Western Blot法在有或无H7存在的情况下,检测芎芪有效成分对血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin及蛋白激酶Cα的mRNA、蛋白表达及分布。结果:实验一:1.对不同时间点各组大鼠脑内EB含量比较:溶栓组大鼠脑内EB含量最高,且EB含量随时间延长不断增多。川芎嗪注射液和黄芪注射液分别可以在溶栓后3h内明显降低大鼠脑内EB含量,而川芎嗪注射液与黄芪注射液合用在溶栓后各时间点均可以明显降低EB含量,与其余各组相比差异显著。川芎组与黄芪组在各时间点相比差异均不显著。2.Z0-1、Occludin的荧光免疫组化检测:在假手术组大鼠,TJ蛋白ZO-1、Occludin均沿血管内皮正常表达。而在溶栓组,ZO-1、Occludin的表达均较假手术组下调明显,且随时间的延长逐渐下降,在川芎、黄芪及联合治疗组,Z0-1、Occludin的表达与溶栓组相比有显著改善。3.Z0-1、Occludin的蛋白半定量检测:溶栓组大鼠脑内Z0-1、Occludin含量最低,且随时间延长不断下降。川芎嗪注射液和黄芪注射液分别可以不同程度的提高溶栓后大鼠脑内ZO-1、Occludin的含量,联合治疗组大鼠的Z0-1、Occludin含量在各时间点较其他组都高,差异具有统计学意义。川芎组与黄芪组在各时间点相比差异均不显著。实验二:1.PKCα、ZO-1、Occludin 的 RT-PCR 检测:溶栓组 ZO-1 mRNA 与治疗组、H7+治疗组、H7组相比表达水平最高;溶栓组PKCα最低;OccludinmRNA与治疗组、H7+治疗组相比较高,与H7组相比差异不显著;H7+治疗组与H7组、治疗组相比,PKCαmRNA较低,Occludin及Z0-1差异不显著;H7组与治疗组之间差异不显著。2.PKCα、Z0-1、Occludin荧光免疫组化检测:在假手术组大鼠,TJ蛋白ZO-1、Occludin、PKCα均沿血管内皮正常表达,而在溶栓组,ZO-1、Occludin的表达均较假手术组下调明显,PKCα表达明显增多;在H7组、治疗组、H7+治疗组中,ZO-1、Occludin较溶栓组蛋白表达均有一定程度的增多,PKCα有一定程度的下降,以H7+治疗组变化最为显著。3.PKCα、ZO-1、Occludin的Western Blot结果显示:假手术组与其余各组相比差异均显著;溶栓组中ZO-1、Occludin含量最低,PKCα最高;H7+治疗组与H7组、治疗组相比,PKCα蛋白水平下降,Occludin及Z0-1差异不显著;H7组与治疗组之间差异不显著。结论:1.川芎及黄芪的中药针剂川芎嗪注射液和黄芪注射液配伍应用,不但可以显著降低溶栓后血脑屏障的通透性,而且很好地保护了紧密连接相关蛋白Z0-1和Occludin.2.芎芪有效成分对PKC信号途径的抑制作用可能是其对血脑屏障保护作用的主要环节。
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