红花的组织培养和品质相关基因的克隆及分析

论文摘要

红花（Carthami Flos）为菊科植物红花（Carthmus tinctorius L.）的干燥管状花,具有抗炎镇痛、扩张冠状动脉、降血压等多种药理作用,临床应用广泛。其中黄酮类成分羟基红花黄色素A （HSYA）是红花的主要活性成分,由此羟基红花黄色素A含量的高低,直接影响红花品质的优劣。因此,从基因水平研究与HSYA生物合成相关的基因,最终从分子水平上定向调控红花品质,为红花的育种提供极大的便利。另外,利用组织培养技术,培育红花的再生再生植株,为快速扩繁红花和验证基因的功能奠定基础。本研究获得的主要结果如下：1.筛选出红花种子的最佳0.1%HgCl2消毒时间为：30分钟；通过对不同部位的外植体（子叶、根、茎、真叶）的诱导比较获知再生体系建立的最佳诱导材料是：子叶；通过试验比较细胞生长素NAA和细胞分裂素6-BA、KT、TDZ不同配比的培养基,筛选获得了最有利于诱导愈伤和诱导形成再生芽的培养基：MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L6-BA+15mg/ LKT和MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L6-BA+20mg/LKT。2.利用高效液相技术完成了对09年红花中HSYA的含量的测定,含量分为0%-2.6%不等.3.采用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends, RACE）技术,首次从红花植物中克隆得到黄烷酮3-羟化酶（F3H）基因。并对该基因进行了蛋白结构的预测和初步的生物信息学分析,F3H基因其全cDNA为1415bp（GenBank登录号：JF737995）包含一个1086bp的开放阅读框（ORF）,编码361个氨基酸残基。4.利用实时定量PCR检测了F3H基因在HSYA含量不同的红花样本中的表达差异。发现在F3H在白花（不含HSYA）中的表达远远低于在黄花（含有HSYA）的表达。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 红花的研究概况
• 1.1 红花的生物学研究
• 1.1.1 外观形态
• 1.1.2 性状
• 1.1.3 显微鉴别
• 1.1.4 理化鉴别
• 1.2 红花的药理活性作用及临床应用研究
• 1.3 红花的化学成分
• 1.4 红花的种质资源研究
• 1.5 红花的综合利用
• 1.5.1 观赏
• 1.5.2 食用
• 1.5.3 药用
• 1.5.4 染料
• 1.5.5 其它方面
• 2 植物组织培养方法研究进展简介
• 2.1 植物组织培养有关的基本概念
• 2.2 植物组织培养方式及应用
• 2.2.1 植物的快速繁殖
• 2.2.2 植物种质资源的保存和交换
• 2.2.3 生产次生代谢产物
• 2.2.4 用于遗传学、细胞生物学、组织学、基因工程、生物工程等
• 2.3 植物基因转化系统的分类
• 3 植物基因克隆技术的的研究进展
• 3.1 利用植物基因表达的产物蛋白质克隆基因
• 3.2 根据已知基因的序列克隆植物基因
• 3.3 cDNA末端快速扩增RACE（rapid amplification of cDNA end）
• 3.4 基因标签法
• 4 研究内容及意义
• 4.1 研究内容
• 4.2 研究意义
• 第二章 红花的组织培养
• 1. 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 种子选择与消毒
• 1.2.2 子叶的愈伤组织诱导
• 1.2.3 茎段、根部、真叶的愈伤组织诱导
• 1.2.4 不同激素处理组合对不定芽的诱导
• 1.3 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同消毒时间对红花种子萌发的影响
• 2.2 子叶愈伤组织的诱导情况
• 2.3 茎段愈伤诱导情况
• 2.4 根部愈伤组织诱导情况
• 2.5 真叶愈伤组织的诱导情况
• 2.6 不同激素处理组合对不定芽诱导的影响
• 3 总结与讨论
• 第三章 红花中羟基红花黄色素A（HSYA）含量的测定
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 色谱条件
• 2.2 对照品溶液的制备
• 2.3 供试品溶液的制备
• 2.4 标准曲线的建立
• 2.5 精密度试验
• 2.6 重复性试验
• 2.7 稳定性试验
• 2.8 回收率试验
• 2.9 含量测定
• 3 结果与分析
• 3.1 羟基红花黄色素A的结构
• 3.2 羟基红花黄色素A的回归方程
• 3.3 精密度试验
• 3.4 重复性试验
• 3.5 稳定性试验
• 3.6 回收率试验
• 3.7 羟基红花黄色素A的HPLC结果
• 第四章 红花中黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 常用生化试剂及酶
• 1.2.2 主要试剂的配制
• 1.2.3 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 总RNA的提取
• 2.1.1 总RNA提取的操作步骤
• 2.2 RACE cDNA文库的构建
• 2.2.1 第一链cDNA的合成
• 2.3 基因特异性引物的设计
• 2.4 contig897片段3’、5’端序列的扩增
• 2.5 胶回收
• 2.6 连接
• 2.7 载体转化
• 2.8 PCR鉴定阳性克隆及测序
• 2.8.1 菌液PCR
• 2.9 F3H基因全长cDNA的获得
• 2.10 生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 3’、5'RACE结果
• 3.3 F3H基因全长cDNA的结果
• 3.4 生物信息学分析
• 3.4.1 CtF3H蛋白质二级结构分析
• 3.4.2 CtF3H蛋白质三级结构分析
• 3.4.3 不同植物的F3H比较
• 3.4.4 CtF3H基因的系统进化树分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 CtF3H的克隆
• 4.2 CtF3H克隆的意义
• 4.3 实验中的问题
• 第五章 F3H基因在不同红花植株中表达差异分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 试剂（盒）和药品
• 2 实验方法
• 2.1 红花花冠RNA的提取及检测
• 2.2 引物设计
• 2.2.1 特异性引物
• 2.2.2 内参引物
• 2.3 反转录反应
• 2.4 实时定量PCR
• 2.5 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 结果
• 3.2 分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 实时定量PCR技术
• 4.2 实时定量PCR在本实验中的应用
• 4.3 研究意义
• 第六章 总结与展望
• 1 本文主要在以下几个方面取得进展
• 1.1 红花组培方面
• 1.2 新疆红花中HSYA含量的测定
• 1.3 红花黄烷酮羟化酶（F3H）基因的克隆
• 1.4 F3H基因在不同红花样本中表达差异
• 2 今后研究方向
• 附录
• 参考文献
• 详细摘要
• Abstract