大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜的制备、评价和应用

论文摘要

水中微生物污染是影响水质的重要因素之一,其中肠道病毒是水中广泛存在的微生物,当前在水处理中最常使用的氯、臭氧和紫外线等多种消毒方法均无法保证对病毒的有效去除。由于饲养生吃海贝的水域被含人肠道病毒（如小型球状病毒）污水污染造成食物中毒的情况在日本频繁发生,更说明目前广泛使用的污水处理方法无法有效去除病毒的污染。为此,发达国家在饮用水、娱乐用水和地下水标准中都引入了肠道病毒指标。我国目前还未将病毒指标列入水质标准中,但随着自然界中动物病毒对人类健康危险性的增加,越来越要求加强对水中病毒的检测,以确保水质安全。水中病毒含量低且需要在敏感细胞内才能自我复制,目前水中病毒检测的标准方法一般包括分离、浓缩富集、增殖、检测四个步骤。首先需要对水样预处理,调节水样的pH,然后用非特异性的正离子或负离子吸附柱,吸附水中带电荷的病毒,用洗脱液将吸附的病毒等物质洗脱下来,调节洗脱液pH,通过絮凝沉淀的方法分离出洗脱液中的病毒,再用小体积缓冲液重新溶解沉淀的病毒,然后用微孔滤膜过滤除去细菌,得到含病毒的水样浓缩液。将浓缩液加入敏感细胞中,培养一定时间（一般为1-3天）后,通过计算病毒在培养的敏感细胞中增殖所产生的噬菌斑形成单位（Plaque forming unit, PFU）等方法确定病毒滴度。由于吸附和浓缩方法缺乏特异性,因此水样浓缩液中存在许多与病毒带相同电荷的微生物如细菌、真菌等,需要通过培养,将可形成噬菌斑的病毒与其它微生物分开。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）和免疫荧光等方法陆续用于病毒检测。分子生物学方法可以检测低浓度的病毒,缩短增殖和检测时间,但仍需要费时复杂的病毒分离和富集过程。因此,尽管目前病毒的分子生物学检测方法发展迅速,但受病毒分离和富集等前处理方法的限制,仍无法快速测定水中的各种病毒,迫切需要可特异性高效分离和富集水中病毒的新方法。静电纺丝（电纺）是将电纺聚合物溶液在高压电场中受到库伦斥力、静电推力和液面表面张力三者之间的相互作用,在适宜的条件下可先是在喷丝口形成泰勒锥,突破临界电压后再以射流的形式分离。射流不断被静电场牵引拉伸,最后溶剂挥发,形成干燥固化的纳米纤维丝状物落在负极上。目前已有相关研究利用电纺将微生物（包括细菌、病毒和细胞）固定在电纺纤维上。据此,我们设想,利用电纺法将病毒固定到电纺纤维上后,洗脱纤维上的模板分子,即可在电纺膜上形成拥有特定的病毒空间结构的分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymer, MIP）,从而可以特异性吸附水中的靶病毒。因此,含有特定病毒空间结构的电纺膜可以作为大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜,特异性分离和富集水中痕量的靶病毒。由于水中微生物数量和种类繁多,往往无法做到对每一种微生物均进行检测,为此,对水中微生物的检测一般采用指示生物,如目前水质标准中采用总大肠杆菌菌群和粪大肠菌群作为肠道细菌的指示菌。肠道病毒与肠道细菌情况类似,也需要采用合适的指示病毒。大肠杆菌噬菌体（Coliphages）作为细菌病毒,在污水中普遍存在且数量高于肠道病毒,对自然条件及水处理过程的抗性高于细菌,接近动物病毒,对人没有致病性。国际标准化组织（International Organization for Standardization, ISO）和美国环境保护总署（Environmental Protection Agency, EPA）均提出用大肠杆菌噬菌体作为肠道病毒指示生物。其中F+RNA噬菌体在性质上最接近肠道病毒,适宜作为肠道病毒的指示物。F+RNA噬菌体对人无害,已大量用于水的病毒学安全评价、污染源追踪、污水处理效率分析等多种研究中。大肠杆菌f2噬菌体是水中常见的F+RNA噬菌体,本研究将以f2噬菌体作为靶病毒,利用静电纺丝技术,在水溶性和生物兼容性较好的聚乙烯醇（Poly vinyl alcohol, PVA）纳米纤维上制备f2噬菌体分子印迹膜,并对其吸附特性和实际应用进行研究。本研究整体分为三个部分：第一部分大肠杆菌f2噬菌体的扩增纯化目的：制备高效价的大肠杆菌f2噬菌体。方法：以大肠杆菌285为宿主菌,用营养肉汤扩增噬菌体f2。以聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）沉淀-氯仿抽提方法纯化扩增的噬菌体,并用双层琼脂平板法检测噬菌体的效价。结果：大肠杆菌f2噬菌体扩增后的效价达到2.45x1010pfu/mL,经PEG沉淀-氯仿抽提方法纯化后效价提高4个数量级,达到6.55x1014pfu/mL左右。结论：聚乙二醇沉淀-氯仿抽提方法可用于制备高纯度f2噬菌体。第二部分电纺法制备大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜及其评价目的：评价所制备的大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜的吸附特性。方法：利用扫描电镜测定不同静电纺丝条件下所制备的大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜的形态,静态吸附实验测定f2噬菌体分子印迹膜的吸附容量和吸附特异性,筛选出最优的电纺条件。测定各种洗脱液对靶噬菌体的吸附回收率,探索效果最好的洗脱液。结果：①不同的电纺条件对电纺纤维形态和电纺速度有明显影响,最佳的电纺条件为：0.5gPVA,5mL纯水,3mL甲醇溶液和2mLSM溶液。喷丝口针头到收集器之间的接收距离为15.7cm,电压15-18kv。在最佳电纺条件下得到的纤维,匀纤细,表面光滑,无珠状纤维和滴液,平均直径在300nm左右,电纺速度为1mL/2h。②经过测试,电纺溶液中的甲醇等溶液对噬菌体的活性影响不大,与噬菌体原液相比,仅降低了约5%噬菌体效价。③10%十二烷基硫酸钠-10%乙酸溶液在超声的辅助下洗脱模板分子后的电纺膜吸附率可以达到82.19%,相对超声与振荡联合,以及单独振荡洗脱方式,在同等环境下的膜吸附效果最好。④静态吸附实验的评价以吸附率（吸附的噬菌体／吸附前的噬菌体）表示。结果显示,4℃下,随着噬菌体浓度的增加,大肠杆菌f2分子印迹膜（MIP）吸附率从60%（104pfu/mL）增加到79%（108pfu/mL）,对照组的非分子印迹聚合物（Non-molecule imprint polymers, NIP）相应地从20%到50%。37℃下,MIP从71.43%（103pfu/mL）到的83.44%（1012pfu/mL）,NIP相应地从53.57%到65.63%。37℃时,f2噬菌体印迹膜对结构不同的另外两种大肠杆菌M13、285P噬菌体的吸附率分别为60%和53.97%,NIP分别为57.33%和63.97%。显示MIP在37-C可有效识别和分离靶f2噬菌体,但存在一定的非特异性识别。⑤SM缓冲液作为洗脱液,f2噬菌体印迹膜的回收率（79%）远大于营养肉汤（50%）或3%牛肉膏-0.05M甘氨酸洗脱液（48%）。结论：①电纺溶液的组成、模板分子的含量、喷丝口针头的大小以及有机溶剂的添加等电纺参数,对电纺可纺性以及运行过程中纺丝状况都有很大的影响。不论是聚合物的质量、针头型号、电压还是接收距离都存在一个可纺范围。有机溶剂的加入可以有效抑制电纺过程中滴液的状况,保持电纺成丝的稳定性。②电纺溶液虽然含有一定量的甲醇,但对噬菌体活性影响不大,相对而言,电纺对噬菌体损伤较大。③洗脱噬菌体后的电纺纤维膜,可特异性识别、结合并有效吸附靶噬菌体。MIP对模板分子f2噬菌体的吸附量高于NIP,对另外两种大肠杆菌DNA噬菌体的吸附与NIP类似,显示MIP对靶噬菌体具有很高的特异性吸附力。MIP对f2噬菌体的吸附率随着初始投入的噬菌体浓度增加而上升。温度升高,布朗运动活跃,使得37℃下的噬菌体吸附效果好于4℃。④对比其它洗脱液,SM缓冲溶液的回收效率最高。第三部分大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜的初步应用目的：评价大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜在自然水体中对大肠杆菌噬菌体f2的吸附效果。方法：取湖水和池塘水,用1 mol/L的HCl将实际水样pH降至3.5后,加入一定浓度的f2噬菌体后,分别利用f2噬菌体分子印迹膜和商品化的硝酸纤维滤膜（0.22μm）吸附水中噬菌体后,测定各种膜对靶噬菌体的加标回收率。.结果：两种环境水样中（湖水和池塘水）均未检测到大肠杆菌f2噬菌体。对加标水样的测定结果显示,MIP对校内池塘和北湖中f2噬菌体的加标吸附率分别为74.80%和68.94%；NIP膜分别为51.50%和41.85%；硝酸纤维滤膜分别为52.45%和43.73%。结论：MIP可特异性分离和富集自然水体中的f2噬菌体,效果优于文献中报道的硝酸纤维滤膜方法,但回收率稍低于纯水中的回收率。由电纺制备的大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜适合用于分离和富集实际水样中噬菌体。本研究的主要结论和创新点：1.主要结论（1）本研究建立了大肠杆菌f2噬菌体的扩增、培养、纯化、浓缩和测定的系列操作方法,制备出纯度较高的噬菌体,并利用双层琼脂培养法检测样品中噬菌体的含量。（2）应用静电纺丝技术,成功制备大肠杆菌f2噬菌体的分子印迹纤维膜。静态吸附实验显示电纺法所制备的大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜可特异性分离和结合靶噬菌体。（3）电纺法制备的大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜可特异性分离和富集实际水样中的f2噬菌体,回收率优于非特异性的商品化硝酸纤维滤膜。2.创新点（1）用静电纺丝制备f2噬菌体分子印迹膜。（2）静电纺丝法所制备的f2噬菌体分子印迹膜具有较高的印迹效果,可特异性和选择性地分离和富集不同水体中靶噬菌体。

论文目录

• 中英文缩略词表 （Abbreviation）
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 高效价噬菌体的制备
• 1. 试剂与材料
• 2. 方法
• 3. 结果和讨论
• 4. 本章小结
• 第二部分 电纺法制备大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜及其评价
• 1. 试剂与材料
• 2. 方法
• 3. 结果和讨论
• 4. 本章小结
• 第三部分 大肠杆菌f2噬菌体分子印迹膜的初步应用
• 1. 试剂与材料
• 2. 方法
• 3. 结果和讨论
• 4. 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述 静电纺丝分子印迹技术的研究进展
• 参考文献
• 致谢