黄瓜花叶病毒运动蛋白与微丝作用关系及胞间连丝通透性调节机制的研究

论文题目: 黄瓜花叶病毒运动蛋白与微丝作用关系及胞间连丝通透性调节机制的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 刘朝辉

导师: 袁明

关键词: 黄瓜花叶病毒,运动蛋白,微丝,胞间连丝

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物体内核酸、蛋白质等大分子物质通过胞间连丝的细胞间转移对植物细胞分化、形态建成及发育具有重要意义。植物病毒运动蛋白可以通过增加胞间连丝的通透性,介导自身和病毒核酸物质的转移。越来越多的证据表明植物病毒运动蛋白是利用或激活了植物体自身大分子物质运输机制,用于其自身及病毒核酸的细胞间转移。因此研究病毒运动蛋白打开胞间连丝的方式,涉及的分子和生化机理,有助于胞间连丝通透性调节的内源机制研究,揭示植物内源大分子物质运输的机理。研究证明,细胞骨架参与胞内运输,被认为参与大分子物质向胞间连丝的运动和定位,同时也参与了胞间连丝的组成,是胞间连丝通透性的调节因子之一。本文探讨了黄瓜花叶病毒运动蛋白(CMV MP)与微丝的作用关系及通过作用于微丝对胞间连丝的调控机制。我们利用大肠杆菌体外表达黄瓜花叶病毒运动蛋白,从包含体中提纯并获得了有一定活性的CMV MP,同时纯化了兔骨骼肌肌动蛋白;利用免疫印迹,共沉淀和荧光观察,证明了CMV MP与肌动蛋白及微丝的结合活性。同时证明它在微丝聚合溶液中能够形成二聚体和聚集体,这种二聚体的形成可能与ATP有关。运用共沉淀结合荧光光度法,电镜,光镜观察证明CMV MP对肌动蛋白聚合过程的影响与CMV MP浓度有关,低浓度CMV MP降低Actin聚合临界浓度,促进聚合;高浓度CMV MP提高Actin聚合的临界浓度,抑制聚合。直接的观察结果显示低浓度CMVMP作用下,呈现的微丝有许多短片段出现,高浓度CMV MP作用下,呈现的微丝基本上呈点状,说明CMV MP不影响Actin成核甚至有助于成核,但抑制微丝的延伸。进一步的观察证明CMV MP对微丝的作用主要是切割作用。这种作用同样与CMV MP作用浓度有关,低浓度CMV MP对微丝的作用不明显而高浓度CMV MP对微丝有明显的切割作用。随着CMV MP反应浓度的增加,在荧光显微镜和电镜下看到的微丝越来越短,在溶液中CMV MP与Actin摩尔比达到1:1以上时微丝均为很小的片断而呈点状结构,观察不到较长的微丝片断;而荧光光度法测定的结果表明,随CMV MP浓度增加而荧光曲线只是稍有下降,说明微丝的总量并未发生明显的变化,因此我们推证看到的短微丝片段主要是由CMV MP的切割效应造成的。CMV MP对微丝的破坏作用可以被稳定微丝的鬼笔环肽所抑制。实验室前期有关病毒运动蛋白体内的工作以及文献报道均表明运动蛋白打开胞间连丝的作用与微丝骨架有关,如果抑制微丝的动态,则运动蛋白不能打开胞间连丝,而破坏微丝结构并不影响胞间连丝的打开。本论文的研究结果证明了,CMVMP对微丝的解聚有浓度依赖性,在细胞中MP的浓度较低,因而并不造成微丝的解聚,而随着MP在胞间连丝处的富集,MP破坏胞间连丝处的微丝,从而扩大胞间连丝的通透性。

论文目录:

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英文摘要

缩写词

第一章文献综述

1.1 胞间连丝研究进展

1.2 病毒运动蛋白研究进展

1.3 细胞骨架参与了大分子物质和植物病毒的细胞内和细胞间的运动

1.4 研究目的和意义

第二章材料与方法

2.1 主要仪器

2.2 主要试剂和材料

2.3 实验方法

第三章结果与分析

3.1 蛋白和抗体的纯化

3.2 CMV MP的自聚合现象

3.3 CMV MP与肌动蛋白及微丝的结合特性

3.4 CMV MP对actin聚合动态的影响

3.5 CMV MP对微丝的作用

第四章讨论

4.1 CMV MP的纯化

4.2 CMV MP能够形成二聚体，继而形成聚集体

4.3 CMV MP与微丝的作用关系

4.4 CMV MP通过作用于微丝调控胞间连丝通透性的可能机制

结论

参考文献

致谢

发布时间: 2005-07-18

黄瓜花叶病毒运动蛋白与微丝作用关系及胞间连丝通透性调节机制的研究

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