论文摘要
目的:胞膜窖,又成为Caveolae,是细胞膜直径约50-100nm的微区域（microdomain）,大量存在于内皮细胞,脂肪细胞,血管平滑肌细胞,纤维母细胞和肺上皮细胞,参与多种细胞生命活动,例如细胞内吞、胆固醇运输、细胞膜组装、信号传导和肿瘤生成等。窖蛋白Caveolin是Caveolae上的特征分子,可与细胞增殖相关的信号分子如H-Ras、c-Src、eNOS、G蛋白等相互作用,参与细胞内物质交换、细胞内外信号传递、组装和浓缩。Caveolin-1分子量22kDaa,由178个氨基酸组成, N端和C端游离在胞浆内,位于N端的第14酪氨酸残基（ Try14）对结合和募集c- Src/Grb7复合物非常重要,这个残基在v- Src癌基因转化的细胞中持续性磷酸化,在生长因子刺激发生暂时性的磷酸化。磷酸化的Try14能结合Grb7并能增强锚定非依赖性的生长和EGF刺激的细胞迁移。因此,酪氨酸磷酸化的Caveolin- 1象一些生长因子受体一样能够招募SH2结构域的蛋白集中到胞膜发挥作用。研究表明,几乎正常细胞均有Caveolin-1的表达,而在乳腺癌细胞和肺癌细胞中, Caveolin-1表达下降或无表达,因此Caveolin-1基因被许多学者认为是候选的抑癌基因。然而近年研究表明,在前列腺癌细胞和膀胱癌细胞中Caveolin-1高表达,而且表达水平与前列腺癌细胞和膀胱癌细胞细胞淋巴道转移潜能呈正相关。所以,深入研究Caveolin-1在不同肿瘤细胞中的作用有重要意义,Caveolin-1已成为近来肿瘤研究的热点。单次跨膜糖蛋白CD147是免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IGSF）的一员,在许多恶性肿瘤细胞的表面富集,作为存在于肿瘤细胞表面的一种粘附分子,介导肿瘤细胞和基质之间的相互作用,诱导成纤维细胞和肿瘤细胞自身基质金属酶MMPs生成,加速肿瘤血管的生成,从而促进肿瘤转移。CD147细胞外2个免疫球蛋白区分别具有激活MMPs和结合Caveolin-1的活性胞外区还含有3个Asn糖基化位点。CD147分子糖基化的程度决定了其激活MMPs的能力,纯化的去糖基化的CD147分子不能诱导MMPs分泌。CD147分子可与MMPs在肿瘤细胞表面形成复合物,使得MMPs聚集在肿瘤细胞周围,有利于肿瘤细胞周围基质的降解,使其易于转移和扩散。目前,我们课题组已经发现,在HCa-F（高淋巴道转移株）中Caveolin-1表达量高于HCa-P（低淋巴道转移株）,在Hepa 1-6（无淋巴道转移）无Caveolin-1的表达,提示Caveolin-1在小鼠肝癌细胞淋巴道转移中可能发挥作用。通过RNA干扰技术特异性使小鼠肝癌细胞株Hca-F中Caveolin-1表达下调,观察对CD147糖基化的影响。Westen Blot结果显示,Hca-F/RNAi细胞中Caveolin-1的蛋白表达与未给予RNA干扰处理的对照组及RNA干扰对照组相比明显下调;同时HG-CD147表达减少,LG-CD147表达增加;且MMPs-11蛋白表达随HG-CD147表达下降而下调。体外迁移、侵袭实验结果显示,与未给予RNA干扰处理的对照组及RNA干扰对照组相比,Hca-F/RNAi细胞迁移及穿过基质胶的侵袭能力下降。结果显示,下调Hca-F细胞中Caveolin-1表达,不但影响HG-CD147表达水平,而且下调MMPs-11蛋白质表达;同时下调的Caveolin-1抑制Hca-F/RNAi细胞体外迁移、侵袭能力。本文针对Caveolin-1﹑CD147糖基化的关系,通过克隆小鼠Caveolin-1cDNA,突变Caveolin-1磷酸化位点,构建其表达载体,将其稳定表达于小鼠肝癌细胞Hepa1-6中,观察稳定转染Caveolin-1磷酸化突变体的Hepa1-6细胞及稳定转染野生型Caveolin-1的Hepal-6细胞对CD147糖基化的影响,为进一步研究Caveolin- 1、CD147在小鼠肝癌细胞淋巴道转移中的作用提供基础。方法:1.突变Caveolin-1的磷酸化位点,克隆至PMD18-T simple vector,亚克隆至真核表达载体质粒pcDNA3.1,经转化、抗生素初步筛选、限制性核酸内切酶酶切和DNA测序获得重组质粒pcDNA3.1/Caveolin-1（Y14F）。2.将克隆至PMD18-T simple vector的Caveolin-1（wt）,亚克隆至真核表达载体质粒pcDNA3.1,经转化、抗生素初步筛选、限制性核酸内切酶酶切和DNA测序获得重组质粒pcDNA3.1/Caveolin-1（wt）。3.利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1/Caveolin-1（wt）与pcDNA3.1/Caveolin-1 （Y14F）转染至小鼠肝癌细胞Hepa1-6中,空载体做对照,经G418筛选,RT-PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达株。4.以Hepa1-6和Hepa1-6/mock为对照,Western blot检测Hepa1-6/Caveolin-1 （wt）和Hepa1-6/Caveolin-1（Y14F）细胞中CD147糖基化变化.结果:1.构建pcDNA3.1/Caveolin-1（wt）和pcDNA3.1/Caveolin-1（Y14F）重组质粒,经XhoLI/EcoRI双酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1表达载体中,记为pcDNA3.1/Caveolin-1（wt）, pcDNA3.1/Caveolin-1（Y14F）。2.获得2个稳定表达外源Caveolin-1（wt）的Hepa1-6细胞株,记为Hepa1-6/Caveolin-1（wt）。1个稳定表达外源Caveolin-1（Y14F）的Hepa1-6细胞株,记为Hepa1-6/Caveolin-1（Y14F）。经RT-PCR、Western blot方法证实外源Caveolin-1（wt）及Caveolin-1（Y14F）在Hepa1-6细胞稳定表达。3. Western blot分析表明,与Hepa1-6/Caveolin-1（wt）相同,在Hepa1-6/Caveolin-1（Y14F）中低糖型CD147（LG-CD147）减少,高糖型CD147（HG-CD147）增加。结论:1.成功构建小鼠pcDNA3.1/Caveolin-1（wt）及pcDNA3.1/Caveolin-1（Y14F）的真核表达载体。2.转染pcDNA3.1/Caveolin-1（wt）及pcDNA3.1/Caveolin-1（Y14F）于Hepa1-6细胞中,使其稳定表达。3.在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中,Caveolin-1磷酸化位点突变（Y14F）没有影响CD147糖基化。
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