论文摘要
离子通道是生命活动的基础,离子通道与肿瘤的关系逐渐引起人们关注,深入了解离子通道在肿瘤形成、发展和转移过程中的作用,不仅有利于更加全面地阐明肿瘤发病机制,也将可能为肿瘤预防和治疗提供新靶标和新的生物学干预手段。钾离子通道是种类最多、最为复杂的一类离子通道,在可兴奋细胞和非可兴奋细胞的信号转导过程中都起着非常重要的作用,也参与肿瘤细胞的增殖和分化的调节。钾离子通道与肿瘤细胞增殖的关系已成为肿瘤基础研究的新热点。ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channels,KATP）将细胞的能量代谢和生物膜电活动耦联起来。细胞生物学和药理学的许多实验证实,钾离子通道在肿瘤细胞增殖和生存的调节机制中起作用。RNAi技术不仅可以发现肿瘤发展过程中基因的变化,而且可能作为肿瘤治疗的一种方法。shRNA（short hairpin RNA,shRNA）可以稳定抑制目的基因。原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,发病率有逐年上升的趋势。虽然诊断和治疗取得了很大进步,但是原发性肝癌患者的生存率低,预后差,仍然需要加强基础研究。目的:构建shRNA质粒表达载体。脂质体法转染肝癌SK-Hep1细胞株,G418筛选,挑选荧光单克隆、扩增。RT-PCR、Western Blot检测基因表达情况。膜片钳检测KATP通道电流。研究细胞生物学特性改变情况。方法:1.构建shRNA质粒表达载体根据shRNA设计原则,设计两条干扰序列1、2和一条非特异性阴性对照序列。shRNA的表达插入的片段由互补的寡核苷酸链退火生成,和经BamH I和Hind III双酶切的线性化空载体pGenesil-3连接,得到三种质粒K1（携带干扰序列1）、K2（携带干扰序列2）、HK（携带非特异性阴性对照序列）,转化感受态细菌DH5a,培养后提取质粒。酶切、测序。2.SK-Hep1细胞的培养、传代、转染、筛选SK-Hep1细胞复苏后,在含有10% FBS的DMEM培养液中连续培养。细胞生长到80-90%运用0.25%胰蛋白酶溶液消化、传代。利用脂质体法转染构建的质粒,经G418进行筛选后,挑选荧光单克隆进行扩增。实验分4组:SK （空白对照）组、SK-K1（转染质粒K1）组、SK-K2（转染质粒K2）组、SK-HK（转染质粒HK）组。提取各组细胞总RNA进行RT-PCR检测Kir6.2基因的表达。WestrenBlot检测Kir6.2蛋白的相对量。3.KATP通道电流的变化采用膜片钳全细胞记录方法记录各组细胞KATP通道电流。高阻封接后,首先用细胞外液进行灌流,再用10mmol/l 2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose,DOG）灌流液灌流10分钟,测量各组的电流,最后换成100uM格列本脲（glybenclimade,Gly）灌流液灌流10分钟,再次测量电流,两次电流相减即可得格列本脲敏感的KATP电流。采用斜坡电压刺激,得到各组的I-V曲线。。4.shRNA沉默SK-Hep1细胞Kir6.2基因后对于细胞生物学特性的影响流式细胞仪检测各组细胞周期。荧光探针Fluo4-AM孵育各组细胞,流式细胞仪检测荧光强度,根据公式计算细胞内钙离子浓度。MTT法检测各组细胞增殖情况,Transwell小室法检测各组细胞体外侵袭能力。结果:1.酶切和测序鉴定显示shRNA构建成功。2.转染、筛选、单克隆扩增RT-PCR结果显示SK-K1组、SK-K2组Kir6.2 mRNA的表达与SK组、SK-HK组比较均明显降低。SK组、SK-HK组Kir6.2蛋白的量与SK-K1组、SK-K2组比较均明显增多。3.KATP通道电流的记录SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组的KATP电流的分别为（n=7）（nA）1.80±0.673,1.87±0.541,5.16±1.011,3.89±1.287。SK-K1组、SK-K2组与SK组、SK-HK组比较电流明显增强（p<0.01）,SK-K1组与SK-K2组比较电流明显增强（p<0.05）。4.细胞生物学特性的变化SK组、SK-HK组与SK-K1、SK-K2组细胞周期相比,G0-G1期细胞明显增加（p<0.05）,S期细胞减少显著（p<0.05）。SK-K1和SK-K2组荧光强度明显弱于SK组（p<0.05）,SK-K1和SK-K2组钙离子浓度远远低于SK组（p<0.05）。Transwell小室法显示SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组细胞的增殖分数分别为0.7523±0.0681,0.7351±0.0589,0.2494±0.0485,0.2261±0.0298。SK-K1组、SK-K2组与SK组比较增殖分数明显降低（p<0.05）。Transwell小室法结果显示SK-K1组、SK-K2组、SK-HK组细胞的穿膜数分别为47.0±7.1,40.7±8.0,14.3±5.1,15.0±3.7。SK-K1组、SK-K2组与SK组比较穿膜细胞明显减少（p<0.05）,SK-HK组穿膜细胞明显多于K1组和K2组（p<0.05）。结论:RT-PCR、Western Blot证实shRNA沉默了SK-Hep1 Kir6.2基因。膜片钳实验证明了干扰后KATP通道电流明显增强,通道开放时K+外流增加。SK-K1、SK-K2组细胞周期G0-G1期细胞明显减少,S期细胞增加显著。SK-K1、SK-K2组荧光强度、细胞内钙离子浓度远远低于对照组。SK-K1、SK-K2组细胞增殖受到抑制,穿膜细胞数明显减少。shRNA沉默SK-Hep1细胞Kir6.2基因影响了细胞生物学特性。